公开了疫苗组合物和用于在无动物成分的培养基中培养包含毒性荚膜多糖的致病菌、分离、纯化多糖和多糖-蛋白质缀合物的方法。荚膜多糖的纯化可以采用或可以不采用酒精用于制备免疫原性制剂。从本发明专利技术的方法获得的免疫原被配制并且不包含动物源和酒精赋形剂的任何来源。还公开了用于流感嗜血杆菌(Haemophilus Influenza)的细菌荚膜多糖的分离、纯化和缀合的方法。用于纯化、内毒素去除和免疫缀合物形成的新颖方法还被用来产生新颖组合物，该组合物负责激发针对Hib的感染的免疫原性和其预防以及其治疗。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】无动物源的不含酒精的疫苗组合物及其制备方法本申请要求2012年7月07日提交的印度临时专利申请第2754/CHE/2012号和2012年7月11日提交的印度临时专利申请第2317/CHE/2012号的优先权。专利
本专利技术涉及无动物源的不含酒精的疫苗。本专利技术还涉及用于制备无动物源的不含酒精的疫苗的方法。一般来说，本专利技术涉及细菌多糖疫苗领域和生物体在具有改良特征的新颖培养基中的培养以及细菌多糖及其缀合疫苗的制造方法。本专利技术还涉及缀合多糖疫苗领域中与细菌多糖和它们的缀合对应物的纯化有关的下游处理。特别地，本专利技术涉及用于在不含动物成分的培养基中培养包含毒性多糖的致病菌，分离、纯化多糖和多糖-蛋白缀合物用于制备免疫原性制剂，而不采用酒精或在有限时期内使用极低量的酒精，从而排除酒精在最终疫苗制品中存在的所有机会的新颖方法。从本专利技术的方法获得的免疫原性制剂不包含任何来源的动物源和/或任何其他酒精赋形剂，因为在纯化步骤中，绝对不使用酒精或在有限的时间段内以非常有限的量使用酒精。专利技术背景细菌病原体可以引起可以既为地方性又为流行性的疾病。由这些病原体引起的大部分的疾病和死亡率在儿童之中为高，尤其在发展中国家中。b型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzaetypeb)(Hib)是幼儿肺炎和脑膜炎的致病生物体。大致2百万疾病案例和450,000例死亡发生在绝大多数发展中国家中；因此，用于该疾病的疫苗需求既于国家又于国际儿童免疫接种计划中刻不容缓[疫苗和免疫的全球计划：对b型流感嗜血杆菌缀合疫苗的WHO立场文件(www.who.int/vaccine-documents/pp-wer/wer7310.Pdf)]。致病菌如脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)、b型流感嗜血杆菌(Hib)、伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)含有引起婴儿、儿童和成人脑膜炎、伤寒、肺炎、菌血症、蜂窝组织炎、骨髓炎、会厌炎、中耳炎、鼻窦炎的毒性多糖。很多革兰氏阴性菌如链球菌(Streptococcus)(肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌(aureus))、脑膜炎奈瑟菌、Salmonellaentericustyphi、b型流感嗜血杆菌(Hib)等具有细胞表面荚膜多糖(CPS)或脂多糖(LPS)或两者，它们帮助病原体建立感染并逃避免疫系统。已经观察到，大多数的这些荚膜多糖的抗体具有防范来自有荚膜的生物体的感染的能力。这些荚膜多糖通过使细菌逃避补体介导的裂解抵御免疫系统。脑膜炎奈瑟菌和肺炎链球菌是人类病原体并且它们毒力的主要原因是荚膜多糖(CPS)。然而，当被纯化时，这些细菌多糖已知是保护性抗原，并且因此能够用于细菌疫苗制备。然而，针对CPS引发的大部分的免疫应答是T细胞非依赖性的，因此免疫记忆、亲和力成熟和同种型转换的诱导不发生，导致在婴儿和儿童中的免疫应答失败。该问题通过引入称为缀合疫苗的新一代疫苗被克服，其中多糖被缀合到诸如蛋白质的载体组/部分，从而将T细胞表位引入多糖上并且将其转化成T细胞依赖性抗原[Vaccinebasedonthecellsurfacecarbohydratesofpathogenicbacteria(2005)AnnalsBrazilianAcd.Sci.77，293-324]。因此，抗细菌疫苗被认为是可以用来控制这类疾病传播的最好的预防措施。在疫苗类型之中，亚单位疫苗例如蛋白抗原或多糖疫苗是最有效的候选物，因为这些疫苗在婴儿和儿童中不仅安全和有效，还预防相同生物体的大量的致病血清型。多种Hib疫苗被广泛用于发达国家，但相对较少的这些疫苗被常规地用于不发达国家。此未充分利用主要是由于这些疫苗的高成本和不可购性。这些疫苗高成本的主要原因是由于无污染物的多糖的次优的回收率和次优的缀合方法。因此，本专利技术对这两个阶段的改进提出建议，从而建立简单、温和、有效率和成本有效的生产方法，以便满足Hib疫苗的高需求的同时在培养过程期间不涉及任何源于动物的产物。纯化的CPS被用于针对这些细菌感染的疫苗的生产。包含荚膜多糖作为抗原的这些细菌疫苗的制备通常在包含优选猪源的动物来源的培养基中制备且在下游加工过程中涉及酒精。因此，最可能的是制成品包含微量的猪材料和酒精。如同将血晶素(hemine)添加至Hib的培养基，肉类培养基被用于培养破伤风梭菌(clostridiumtetani)且动物蛋白胨被用于培养肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌。经培养的多糖和缀合蛋白的纯化程序常常包括长期的乙醇分级分离、酶消化和酚提取技术。酒精和非素食食物或源自任何动物来源的食物材料的消耗在很多宗教中被禁止。在动物产品和酒精的消耗不被政府或宗教团体禁止的国家或州中，关于这些材料的使用留给个人的愿望来自己决定，然而在对酒精和动物产品的使用没有限制的那些国家中，有深厚宗教信仰的公民或宗教思想坚定的追随者制止自己消耗任何源自动物或包含酒精的食物材料。特别地，消耗酒精、摄入特别来源于猪(swine或porcine)的肉类在如伊朗、伊拉克、埃及、沙特阿拉伯、马来西亚、一些其他中东和海湾国家的伊斯兰教地区的国家中被严格禁止。他们把这些事物称作HARAM，其意指作为他们宗教信仰的一部分为非法或禁止的。甚至有时包含可忽略的量的酒精或微量的猪来源的药物制剂也被他们避开。因此，明显的是，在那些遵循严格伊斯兰信仰的国家中的人口的一部分仍然要被治疗，因为由于完成的疫苗产品中可能含有猪和酒精成分，他们不喜欢针对以上提到的疾病给自己接种疫苗。在现有技术中制备和使用的各种疫苗从基于动物源的来源生长的培养基来制备、使用大量的酒精来分离和纯化，因此其包含酒精赋形剂和动物来源，这限制了它们作为伊斯兰种族和宗教保守派群体之中广泛接受的疫苗的使用。因此，无动物来源和酒精赋形剂的免疫原性制剂可以广泛用于这些地区而没有任何宗教或地理限制，所述免疫原性制剂还可以被称为HALAL疫苗，意指在伊斯兰法下合法或许可的。例如，阿布扎比卫生局(HealthAuthorityofAbuDhabi,HAAD)提议为所有到麦加进行Al朝觐(AlHajj)的哈吉(Hajj)朝圣者强制制作疫苗接种证明。由于数以百万计的伊斯兰追随者为此吉利原因去往麦加，所以在没有任何预防方法下很可能发生疾病。在HAAD哈吉责任下强制接种的疫苗是脑膜炎球菌(Meningococcal)疫苗、季节性流感疫苗和肺炎球菌疫苗，以使旅行者免于脑膜炎、流感和肺炎球菌疾病。(http://www.haad.ae/HAAD/tabid/1198/Default.aspx)在此方案中，HALAL疫苗将一直证明是朝圣者的额外好处和目前的潜在需要，这是因为HALAL疫苗绝对使残留动物成分和酒精成分在最终疫苗组合物中出现的机会否定至不存在，因为没有介入动物成分并且在纯化期间没有涉及酒精成分或者在HALAL疫苗组合物的生产和纯化中可能涉及非常有限量的酒精。常规的脑膜炎疫苗已经被所述国家的某些认证为清真疫苗，因为他们接受疫苗制备期间使用动物产品但不使用任何猪肉产品。然而，这类HALAL认证仅基于不使用猪肉产品而给出，但它们可以包括来自其他动物的来源。被称为HALAL的本申请的本文档来自技高网...
【技术保护点】
疫苗组合物，其用于预防由脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)、'b'型流感嗜血杆菌(Meningitidis,Haemophilus influenzae type'b')、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、肺炎链球菌(Streptococcal pneumonia)引起的感染，所述疫苗组合物在合适佐剂存在下或不存在下包含脑膜炎奈瑟菌、'b'型流感嗜血杆菌、伤寒沙门菌、肺炎链球菌的荚膜多糖作为抗原，和包含糖类的组合作为稳定剂，所述荚膜多糖缀合至载体蛋白，所述载体蛋白选自白喉类毒素和破伤风毒素；所述糖类选自蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖，其中所述疫苗制剂不包含任何动物成分和酒精。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.07.07 IN 2754/CHE/2012;2012.07.11 IN 2317/CHE1.由细菌培养物纯化荚膜多糖、去除荚膜多糖的内毒素和回收荚膜多糖的方法，所述方法不涉及酒精和任何动物成分，包括以下步骤：a.在冷却条件下使用100kD截止膜以8000转每分钟(RPM)离心所述细菌培养物，并且收集上清液；b.通过连续模式离心或批式离心使所述上清液浓缩至其原始尺寸的四分之一；c.将10％十六烷基三甲基溴化铵添加至步骤b的浓缩的上清液，并且在搅拌条件下室温将其孵育3小时；d.以3L/分钟的流速将步骤c的上清液加样到深度过滤器上，直到十六烷基三甲基溴化铵沉淀物被收集，并且在室温下使用注射用水(WFI)清洗所述沉淀物，直到滤液的电导率为0；e.溶解步骤d的沉淀物，并且使用0.5MNaCl洗脱以提供荚膜多糖洗脱液；f.添加步骤e的所述荚膜多糖洗脱液，用WFI稀释以得到0.2MNaCl浓度来收集所述上清液，接着将所述上清液相对于10mMpH7的磷酸缓冲盐水(PBS)渗滤以获得部分纯化的荚膜多糖；g.使用TritonX114相分离技术去除步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：克里希纳·默斯·艾拉，文卡特桑·拉马沙米，曼达拉普·甘加达尔·奈杜，安纳姆拉珠·达塔特瑞亚·萨尔玛，
申请(专利权)人：巴拉特生物技术国际有限公司，
类型：发明
国别省市：印度;IN
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