一种PAGE的高效银染方法技术

本发明专利技术属于分子遗传学领域，具体涉及一种适用于聚丙烯酰氨凝胶的高效银染方法。所述方法包括步骤：1)取下凝胶，浸泡在固定液中，处理2分钟，所述固定液的配方为：10％Ethanol；1.0％Acetic acid；2)把凝胶取出放入0.2％AgNO3渗透液中处理3分钟，取出凝胶，迅速放至水中，清洗20秒；3)把凝胶放进显色液中，2分钟即可显色，所述显色液配方为2％NaOH；20mL 37％HCOH/L；0.0175‰Na2S2O3。本发明专利技术的银染过程可在10分钟内完成，几乎是已报到的银染方法中需时最少的，显著提高了实验的效率。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于分子遗传学领域，具体涉及一种适用于聚丙烯酰氨凝胶的高效银染方法。所述方法包括步骤：1)取下凝胶，浸泡在固定液中，处理2分钟，所述固定液的配方为：10％Ethanol；1.0％Acetic acid；2)把凝胶取出放入0.2％AgNO3渗透液中处理3分钟，取出凝胶，迅速放至水中，清洗20秒；3)把凝胶放进显色液中，2分钟即可显色，所述显色液配方为2％NaOH；20mL 37％HCOH/L；0.0175‰Na2S2O3。本专利技术的银染过程可在10分钟内完成，几乎是已报到的银染方法中需时最少的，显著提高了实验的效率。【专利说明】一种PAGE的高效银染方法
本专利技术属于分子遗传学领域，具体涉及一种适用于聚丙烯酰氨凝胶的高效银染方 法。
技术介绍
聚丙烯酰氨凝胶电泳是目前常用的检测DNA的方法，其分辨率好，能检测出DNA片 段间甚至lbp大小的差异，且通量高，可以在样品量较少的情况下进行大批量的检测。银染 法凭借其毒性轻、污染小等优点，是聚丙烯酰氨凝胶电泳中常用的一种染色方法。 该染色技术的首次应用是在蛋白的检测上（Switzeretal. 1979)，随后该技术被 广泛的应用在核酸的检测上（Guoetal. 2008)。如今随着数量性状的遗传定位、遗传图谱 的构建、关联分析等研宄的快速发展，越来越多的核酸片段需要银染法来染色检测（Liang etal. 2014)。然而传统的银染方法往往药品配置复杂、过程繁琐、所需时间较长。 本专利技术优化了各个处理液的配方，且在不影响检测灵敏度的基础上大幅缩短了银 染所需时间，提高了实验效率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一套适用于聚丙烯酰氨凝胶的高效银染方法。 根据本专利技术的方法，通过配制固定液、渗透液和显色液中主要药品的不同浓度，对 聚丙烯酰胺凝胶银染方法中各个药品的最适浓度进行了探讨和改良。并经过大量的实验， 摸索出了在不影响染色质量的情况下三种处理液的较短处理时间，显著提高了实验效率。 根据本专利技术的适用于聚丙烯酰氨凝胶的银染方法包括以下步骤： 1)聚丙烯酰氨凝胶电泳结束后，取下凝胶，浸泡在固定液中，处理2分钟，所述固 定液的配方为：1〇%体积比乙醇；1. 0%体积比乙酸； 2)随后取出凝胶，迅速放至水中，清洗20秒；把凝胶取出放入0? 2wt%，AgNCV渗 透液中处理3分钟，取出凝胶，迅速放至水中，清洗20秒； 3)把凝胶放进显色液中，2分钟即可显色，所述显色液配方为2wt%NaOH; 20mL37v%HCOH/L;0? 0175wt%。Na2S203。 根据本专利技术的【具体实施方式】，所述方法包括以下步骤： 1)棉花基因组DNA的提取 把棉花种子浸泡于温水中过夜，随后沙培于光照培养箱内，培养一周左右至新鲜 叶片展开，选取鲜嫩叶片〇.5g在液氮中迅速碾磨至微白粉末，提取方法按照高含量酚的 CTAB法，并稍作改进。提取的DNA浓度和质量分别用0. 8%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光 光度计测定。把DNA原液稀释至适宜浓度后放至-20°C保存备用。 2) PCR扩增反应和聚丙烯酰氨凝胶电泳 PCR扩增程序为：95°C预变性2min;94°C变性40s，55°C退火45s(不同引物退火温 度有稍微区别），72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸10min，4°C保存。 8%的聚丙烯酰氨凝胶电泳检测：采用BIO - RAD公司的PowerlOOO型电泳仪， PROTEANIIXICell电泳槽装置。在扩增产物中加入0.5倍体积的上样缓冲液，采用8% 的聚丙烯酰胺凝胶检测产物。 3)聚丙烯酰胺凝胶的银染 聚丙烯酰氨凝胶电泳结束后，取下凝胶，浸泡在固定液（10%Ethanol;1.0% Aceticacid)中，处理2分钟，当固定液中含有乙醇时，条带与凝胶的对比度有少量改善， 条带更加明显（图1)，乙酸含量的稍微改变对凝胶显色结果影响微乎其微；随后取出凝胶， 迅速放至水中，清洗20秒；把凝胶取出放入渗透液（0. 2%AgN03)中处理2分钟，当银离子 浓度为〇. 2%时，渗透处理2-3min即可达到较好的效果，银离子浓度减低时需适当加长渗 透时间，当银离子浓度达到0. 3%或更高时，凝胶整体背景变深（图2);取出凝胶，迅速放至 水中，清洗20秒；最后，把凝胶放进显色液（2%NaOH;20mL37%HC0H/L;0. 0175°/4Na2S203) 中，3分钟即可显色，显色结果理想。当氢氧化钠浓度小于1%时，凝胶底色开始明显加重， 条带与底色的对比度降低，且随着氢氧化钠浓度的降低，这种现象越严重。较高的氢氧化钠 浓度对实验结果的影响不是很大。甲醛（37%)的浓度过低时会导致条带不明显，处理时 间加长，且会导致凝胶背景变暗红，当浓度大于15mL37%HC0H/L时，显色效果理想，在120 转/分钟的晃动下3min中即可得到很好的显色结果（图3)。所有处理过程都在120转/ 分钟的摇床上处理。处理中晃动频率的降低会延缓实验时间。 理想的银染技术应具备分辨率高、重复性好、操作简单快捷等特征。通过该银染方 法来处理聚丙烯酰胺凝胶，条带显色良好，小片段条带清晰，条带与凝胶背景对比度好。本 专利技术的银染过程可在10分钟内完成，几乎是已报到的银染方法中需时最少的，显著提高了 实验的效率。 【专利附图】【附图说明】 图1显示固定液中不同乙醇浓度对凝胶的显色影响。A:乙醇的浓度为10%;B:无 乙醇； 图2显示渗透液中不同硝酸银浓度对凝胶的显色影响。A :AgN〇j^浓度为0.3%; B:AgN〇j^浓度为0.05% ; 图3显示显色液中不同浓度的甲醛、氢氧化钠对凝胶的显色影响。A:甲醛（37%) 的浓度为〇. 5%;B:甲醛（37% )的浓度为2%;C:NaOH的浓度为0. 5%;D:NaOH的浓度为 2% ； 图4不同染色方法银染聚丙烯酰胺凝胶的显色结果，其中，A是通过本专利技术的方法 银染聚丙烯酰胺凝胶的显色结果；B是通过陈浩东等（2013)所使用的银染方法银染聚丙烯 氨酰胺凝胶的显色结果。 【具体实施方式】 实施例1 1)实验材料 实验材料为陆地棉（Gossypium.hirsutum)栽培种中棉所12和四倍体野生种 达尔文氏棉（G.darwinii)F2群体，来源于中国农业科学院棉花研宄所。SSR引物序列为 swul9357〇 2)棉花基因组DNA的提取 把棉花种子浸泡于温水中过夜，随后沙培于光照培养箱内，培养一周左右至新鲜 叶片展开，选取鲜嫩叶片〇. 5g在液氮中迅速碾磨至微白粉末，提取方法按照高含量酚的 CTAB法，并稍作改进。提取的DNA浓度和质量分别用0. 8 %的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光 光度计测定。把DNA原液稀释至适宜浓度后放至-20°C保存备用。 3) PCR扩增反应和聚丙烯酰氨凝胶电泳 PCR扩增程序为：95°C预变性2min ;94°C变性40s，55°C退火45s(不同引物退火温 度有稍微区别），72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸10min，4°C保存。 8%的聚丙烯酰氨凝胶电泳检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适用于聚丙烯酰氨凝胶的银染方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)聚丙烯酰氨凝胶电泳结束后，取下凝胶，浸泡在固定液中，处理2分钟，所述固定液的配方为：10％Ethanol；1.0％Acetic acid；2)随后取出凝胶，迅速放至水中，清洗20秒；把凝胶取出放入0.2％AgNO3渗透液中处理3分钟，取出凝胶，迅速放至水中，清洗20秒；3)把凝胶放进显色液中，2分钟即可显色，所述显色液配方为2％NaOH；20mL 37％HCOH/L；0.0175‰Na2S2O3。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：崔兴雷，孟菲，蔡小彦，刘方，周忠丽，王星星，王春英，王玉红，王坤波，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41