一株氯氰菊酯降解菌及其菌粉在茶园茶树中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体来说是一种氯氰菊酯降解菌及其菌粉在茶园茶树中的应用，将氯氰菊酯降解菌的菌粉按质量体积百分比为0.001％～0.005％的比例复溶于无菌水或1～15％脱脂奶粉溶液中，再将菌粉悬液按照体积比1～5:100的比例喷洒至含氯氰菊酯的茶园茶叶上，7d后降解率达80％以上；所述菌粉是由氯氰菊酯降解菌菌株制备而成，氯氰菊酯降解菌菌株于2016年8月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.12886。本发明专利技术工艺简单易行，适合工业化生产，所得发酵剂具有含活菌数量高、保质期长、发酵乳性能优良、使用简单、使用量少等优点。

Application of Cypermethrin Degrading Bacteria and its powder in tea plant

The present invention relates to the field of biotechnology, is the application of a Cypermethrin Degrading Bacteria and fungus powder in tea in particular, the bacteria powder of Cypermethrin Degrading Bacteria according to the quality of the volume percentage of 0.001% to 0.005% the proportion of redissolved in sterile water or 1 ~ 15% skim milk solution, then the bacteria powder suspension according to volume ratio of 1 to the ratio of 5:100 to cypermethrin spraying chlorine tea tea, the 7d degradation rate was more than 80%; the bacteria powder is made of Cypermethrin Degrading Bacteria strains were prepared, Cypermethrin Degrading Bacteria Strains in August 22, 2016 preserved in common microbe microbial culture collection center Chinese the Committee (CGMCC), the preservation number is CGMCC NO.12886. The method has the advantages of simple and easy operation, and is suitable for industrial production, and the obtained fermentation agent has the advantages of high quantity of live bacteria, long shelf life, excellent performance of fermented milk, simple use, little use, etc..

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体来说是一种氯氰菊酯降解菌及其菌粉在茶园茶树中的应用。
技术介绍
氯氰菊酯(Cypermethrin)是最常用的拟除虫菊酯类农药之一，广泛应用于农作物、牲畜等害虫的防治。但随着氯氰菊酯的频繁使用，有关该农药的残留问题及其危害性也日益暴露出来。已有研究显示，氯氰菊酯对某些有益昆虫及水生生物具有很高的毒性，对人体具有神经毒性、蓄积毒性及生殖毒性，已被美国环境保护局列为致癌物质。生物降解是解决农药残留的新途径之一，但目前对于氯氰菊酯降解菌株的研究报道有限，且由于土壤环境复杂，菌株实际降解能力难以达到实验室水平，可应用于降解环境农药残留的微生态制剂的制备更是少有报道。茶叶是我国重要的农产品之一，也是传统的大宗出口商品。在茶叶种植中，以氯氰菊酯为主的拟除虫菊酯类农药广泛用于茶园虫害的防治，其残留量也是逐渐上升；目前茶叶进口国，特别是欧盟、日本等经济发达国家，对进口茶叶均制定了更为苛刻的农药最大残留限量(MRL)标准。由于农药残留问题，我国茶叶出口面临着严峻的考验和巨大的危机，因此消除或减少茶叶中的氯氰菊酯残留是一大热点问题。因此，筛选适应性强，环境友好的降解菌株是解决上述问题的根本方法。研究可进一步丰富广谱性拟除虫菊酯降解菌资源库，为受氯氰菊酯污染茶树的生物修复及进一步保障其食用安全提供菌株资源和理论基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述技术存在的问题，提供一种氯氰菊酯降解菌BBCP-017及其菌粉在茶园茶树中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一株氯氰菊酯降解菌的菌粉在茶园茶树中的应用，将氯氰菊酯降解菌的菌粉按质量体积百分比为0.001％～0.005％的比例复溶于无菌水或1～15％脱脂奶粉溶液中，再将菌粉悬液按照体积比1～5:100的比例喷洒至含氯氰菊酯的茶园茶叶上，7d后降解率达80％以上。本专利技术氯氰菊酯降解菌，为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BBCP-017，是从耕地土壤中通过富集驯化、梯度培养法筛选得到；该菌株已于2016年8月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.12886。本专利技术提供一种氯氰菊酯降解菌的菌粉的制备方法，将氯氰菊酯降解菌菌株接种至种子培养基，于34～40℃振荡培养12～36h，再转接至发酵培养基中，于34～40℃振荡发酵培养48～72h，置于-20～-80℃冷冻处理1～8h，再于78～85℃水浴处理1～4h，3000～8000rpm离心10～30min，在无菌条件下收集菌泥复溶于0.8～1.5％NaCl溶液中，进行二次离心，3000～5000rpm离心10～30min，随后将得到的二次离心菌泥与冻干保护剂按照1:1～5的重量比混合均匀，-38～-42℃真空冷冻干燥后制成含菌量为0.5～2.5×1011CFU/g的菌粉。进一步的，所述发酵培养基配方为：胰蛋白胨0.3～1.5％、酵母浸出粉0.3～1.5％、NaCl0.3～1.5％、MnSO40.01～0.25％，蒸馏水1000mL。进一步的，所述发酵培养基的pH为6.5～7.5。进一步的，所述冻干保护剂配方为：脱脂奶粉5～20％、葡萄糖0.5％～5％、蒸馏水1000mL。进一步的，所述冻干保护剂pH为6.3～6.8。本专利技术的有益技术效果是：1、菌粉制备工艺简单易行，适合工业化生产，具有含活菌数量高、保质期长、使用简单、使用量少等优点。2、菌粉使用方便，操作简单，只需要简单复水或者溶解于1-15％的脱脂奶粉溶液中，就可直接使用，不需要连续扩培繁殖传代，减少不必要的浪费。3、菌粉应用于茶园茶叶中能有效降解体系中的氯氰菊酯，是可应用于受氯氰菊酯污染茶叶的生物修复剂。4、产品性能稳定，可在4℃以下冷冻保存，保质期长达36月；在室温条件下也可维持18月的发酵活力；同时方便运输，适合长距离配送。5、本专利技术筛选的氯氰菊酯降解菌-蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌粉复溶于无菌水后喷洒至含氯氰菊酯的茶树中，7d后降解率达80％以上；说明本专利技术的蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌粉具有环境生物修复的应用价值以及广阔的应用前景。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1本专利技术氯氰菊酯标准曲线。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1蜡样芽孢杆菌BBCP-017的分离、纯化①土样处理：采自长期施用氯氰菊酯的耕地土壤，经自然风干过80目筛备用。②降解菌的富集驯化：取1.0g土样加入氯氰菊酯浓度为20mg/L的基础盐培养基，于37℃振荡(180rpm)培养24h后，取5％(v/v)培养液转接至氯氰菊酯浓度为40mg/L的基础盐培养基中，按照上述操作连续转接3次，培养基中氯氰菊酯浓度逐次提高至160mg/L。③降解菌的筛选纯化：驯化后，将菌液(OD600nm＝1.0)进行梯度稀释涂布转接到氯氰菊酯浓度为40mg/L的固体平板上，37℃培养24h，挑取单菌落于相同的固体平板连续划线纯化三代，挑选出菌落形态规则、生长速度最快的氯氰菊酯降解菌株BBCP-017；并将其保存于种子斜面，备用。④氯氰菊酯降解菌株BBCP-017经形态、生理、分子鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)；该菌株已于2016年8月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.12886。⑤上述培养基的配方由以下重量体积比计的组分组成。基础盐培养基：(NH4)2SO40.05～0.25％，KH2PO40.05～0.25％，K2HPO40.05～0.25％，MgSO40.05～0.25％，NaCl0.05～0.25％，蒸馏水1000mL，pH6.8～7.5；种子培养基：胰蛋白胨0.5～1.5％，酵母浸出粉0.25～1％，NaCl0.25～1.5％，蒸馏水1000mL，pH6.5～7.5；固体培养基同液体培养基加入2.0％的琼脂；121℃灭菌20min。灭菌后在无菌条件下加入一定体积的氯氰菊酯溶液使其为试验所需浓度，混匀备用。实施例2蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌粉的制备①种子液制备：从实施例1中保存的种子斜面中挑取蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌落，接种于50mL种子培养基中，初始pH7.0，37℃振荡(180rpm)培养24h，即为种子液。②发酵培养：以5％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，锥形瓶装液量为250mL/500mL，初始pH7.0，37℃振荡(180rpm)培养48h，结束培养。③收集菌体：将发酵培养液于-40℃冷冻处理4h，取出，再于80℃水浴处理2h，制片经本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株氯氰菊酯降解菌的菌粉在茶园茶树中的应用，其特征在于，将氯氰菊酯降解菌的菌粉按质量体积百分比为0.001％～0.005％的比例复溶于无菌水或1～15％脱脂奶粉溶液中，再将菌粉悬液按照体积比1～5:100的比例喷洒至含氯氰菊酯的茶园茶叶上，7d后降解率达80％以上；所述菌粉是由氯氰菊酯降解菌菌株制备而成，所述氯氰菊酯降解菌菌株于2016年8月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.12886。

【技术特征摘要】
1.一株氯氰菊酯降解菌的菌粉在茶园茶树中的应用，其特征在于，将氯氰菊酯降解菌的菌粉按质量体积百分比为0.001％～0.005％的比例复溶于无菌水或1～15％脱脂奶粉溶液中，再将菌粉悬液按照体积比1～5:100的比例喷洒至含氯氰菊酯的茶园茶叶上，7d后降解率达80％以上；所述菌粉是由氯氰菊酯降解菌菌株制备而成，所述氯氰菊酯降解菌菌株于2016年8月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNO.12886。2.一种氯氰菊酯降解菌的菌粉的制备方法，其特征在于，将氯氰菊酯降解菌菌株接种至种子培养基，于34～40℃振荡培养12～36h，再转接至发酵培养基中，于34～40℃振荡发酵培养48～72h，置于-20～-80℃冷冻处理1～8h，再于78～85℃水浴处理1～4h，3000～8000rpm离心10～30min，在无菌条件下收集菌泥复溶于0.8～1.5％...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐洁，刘波，张庆，陈廷廷，史颖，曾朝懿，曾林，谭宵，
申请(专利权)人：西华大学，
类型：发明
国别省市：四川;51