一种高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法技术

本发明专利技术属于细胞免疫学技术领域，具体地说是一种高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法，包括如下步骤：1)采集外周静脉血，获得单个核细胞；2)进一步分离获得单核细胞和悬浮细胞；3)单核细胞诱导分化为成熟的DC；4)CD3+CD8+CIK细胞的诱导培养；5)D-CIK细胞的诱导培养，得到一种新的异质性细胞群，即D-CIK细胞。通过本发明专利技术所制备的D-CIK细胞与CIK细胞比较，增值活性和细胞毒活性更强，同时具有制备工艺简单、成本低廉、易于规模化生产等优势。通过本发明专利技术所制备的D-CIK细胞，其应用主要为癌症病人的治疗或者癌症高危人群的预防。

【技术实现步骤摘要】
—种高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法
本专利技术属于细胞免疫学
，具体地说是一种高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法。
技术介绍
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinduced killer cell, CIK)是 Schmidt 等于1986年报道的从外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中诱导出的一群异质性细胞。其主要效应细胞因同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，因此又被称为NK细胞样T淋巴细胞(NKT细胞)。体内外的实验研究表明，CIK细胞具有杀瘤活性高、增值速度快、抗凋亡及杀瘤效应不受癌细胞多重耐药的影响等优势。树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前所知功能最强的抗原递呈细胞(antigen-presenting cell, APC),表面具有丰富的有助于抗原呈递的分子,如主要组织相容性复合体 1、II (major histocompatibility complex I/I I, MHC I/II)、CD80/86、CD40、ICAM-1等共刺激分子，能有效的激活初始型T细胞(naiVe T cell)使其活化和增值，启动特异性免疫应答反应，发挥有效的抗肿瘤效应。树突状细胞调节的细胞因子诱导的杀伤细胞(dendritic cell activated andcytokine induced killer cell, D-CIK)是指将成熟的DC与同源的CIK细胞同培养而形成的一群异质性细胞群。共培养既可以促进DC分泌IL-12，又可以促进CIK细胞的增值，并加强其抗肿瘤活性。Marten A等研究发现，IL-12摄取阻断会减弱CIK细胞的细胞毒活性。因此,D-CIK细胞应用于恶性肿瘤患者的治疗，有助于解除肿瘤患者体内T细胞的免疫无能，从而提高抗肿瘤活性。现有CIK细胞制备技术中存在:(1)CIK细胞中绝大部分群体为⑶3+⑶8+T淋巴细胞，大约占CIK细胞的60%左右，然而其杀瘤活性却受到极大的限制；这与目前的CD3+0)8+T淋巴细胞,也即细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)是抗肿瘤的主要免疫效应细胞的认识存在差异。(2)虽然主要效应细胞一NKT细胞，扩增1000倍左右，但整体细胞群体扩增能力较为有限，大约80~100倍左右。DC制备技术中存在，成熟DC分泌IL-12因子的水平偏低。二者共培养后，增值能力和细胞毒活性提高不显著等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，通过选择优化的CIK细胞和DC培养方案的基础上，对CIK细胞和DC共培养方案进一步改进，提供了一种新的人D-CIK细胞的制备方法及其应用，解决了现有技术CIK细胞与DC共培养后，异质性细胞群体增值能力和细胞毒活性提高不显著等问题。本专利技术所提供的人D-CIK细胞，是指以CD3+CD8+T淋巴细胞为主效应细胞，在人D-CIK细胞异质性群体中约95%，与K562细胞共培养8小时对肿瘤细胞杀伤活性可达93%左右。CD3+CD8+T淋巴细胞其表面标记为:人白细胞分化抗原CD3、人白细胞分化抗原CD8和人a PTCR受体。本文中的“⑶3+⑶8+CIK细胞”表示CD3和⑶8均为阳性的CIK细胞。为实现上述目的，设计一种高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法，包括如下步骤:I)采集外周静脉血，获得单个核细胞；2)进一步分离获得单核细胞和悬浮细胞；3)单核细胞诱导分化为成熟的DC;4)CD3+CD8+CIK细胞的诱导培养；5) D-CIK细胞的诱导培养。作为优选，所述步骤I)为将外周静脉血经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞；所述步骤2)为通过贴壁法将上述单个核细胞进一步分离获得单核细胞和悬浮细胞。进一步地，所述步骤I)具体为采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法分离收集，并用生理盐水洗涤2次，低速离心后获得PBMCs。所述步骤2)具体为将获取的PBMCs重悬于PAA?培养基、GT-T551?培养基、OPt1-MEM?培养基中的任意一种，然后于37°C，5% C02和饱和湿度的培养箱内静止2h，吸取其中悬浮细胞另行CD3+CD8+CIK细胞诱导培养，贴壁细胞则为单核细胞。作为优选，所述步骤3)具体包括:将含有8-10%白体血浆、800_1000IU/mlGM-CSF、800-1000IU/ml IL-4的X-VIV0-15?培养基或者AM-V?培养基加入获取的单核细胞中，继续培养；培养2-3天后，更换新鲜培养基，并在新鲜培养基中加入I~20 μ g/ml的肿瘤抗原，继续培养；培养1-2天后，加入IL-Ιβ、IL-6、TNF-a，或者IL-1 β、IL_6、TNF_ a与Mtb-HAg及IFN- Y中的一种或者两种的组合；继续培养1-2天，进行DC成熟度和IL-12含量检测。作为优选，所述步骤3)中加入的IL-Ιβ终浓度为8-15ng/mL，IL_6终浓度为50-150ng/mL, TNF- a 终浓度为 8_15ng/mL，Mtb-Hag 终浓度为 5 ~10 μ g/ml, IFN- Y 终浓度为 100 ~1000IU/ml ;GM_CSF 浓度为 800IU/ml、IL-4 浓度为 1000IU/ml ;所述的 DC 成熟度的检测方法为流式细胞术，IL-12含量检测方法为ELISA。进一步地，所述步骤3)中加入的IL-1 β终浓度为10ng/mL，IL-6终浓度为IOOng/mL, TNF- α 终浓度为 10ng/mL，Mtb-Hag 终浓度为 8 μ g/ml, IFN- Y 终浓度为 1000IU/ml。作为优选，所述步骤4)具体包括:将步骤2)中收集的悬浮细胞重悬于含8-10%自体灭活血浆的PAA?或者GT-T551?等商品化无血清培养基中，调整细胞密度(1_2) X IO6/ml左右，并加入IFN-Y至终浓度500-1500IU/ml，最后转移入培养瓶内进行培养；培养20-28小时后加入抗⑶3单抗、抗⑶28单抗、IL-1 α、IL-2,40-50小时后加入卡介苗(bacillus Callmette-Guerin,BCG)连续培养6~7天,其中每2~3天补加含有IL-2的新鲜培养基，使补加培养基后的细胞密度控制在(1-2) X106/ml。作为优选，所述步骤4)中所加入的抗⑶3单抗浓度为50~500ng/ml，抗⑶28单抗的浓度为50~500ng/ml，IL-1 α的浓度为0.5~5ng/ml，IL-2的浓度为50~1000IU/ml ;加入卡介苗的浓度为5~20 μ g/ml。进一步地，所述步骤4)中IFN- Y的浓度为1000IU/ml，培养20_28小时候加入抗CD3单抗浓度为100ng/ml，抗CD28单抗的浓度为200ng/ml，IL-1 α的浓度为lng/ml，IL-2的浓度为1000IU/ml，40-50小时后加入BCG的浓度为10 μ g/ml。作为优选，所述步骤5)具体包括:将步骤3)及步骤4)中培养的DC和CD3+CD8+CIK 收集并重悬于含有 5 ~20 μ g/ml 的 BCG、50 ~本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高毒性、高增值能力的人D?CIK细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤：1)采集外周静脉血，获得单个核细胞；2)进一步分离获得单核细胞和悬浮细胞；3)单核细胞诱导分化为成熟的DC；4)CD3+CD8+CIK细胞的诱导培养；5)D?CIK细胞的诱导培养。

【技术特征摘要】
1.一种高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤: 1)采集外周静脉血，获得单个核细胞； 2)进一步分离获得单核细胞和悬浮细胞； 3)单核细胞诱导分化为成熟的DC； 4)⑶3+⑶8+CIK细胞的诱导培养； 5)D-CIK细胞的诱导培养。2.如权利要求1所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤I)为将外周静脉血经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞；所述步骤2)为通过贴壁法将上述单个核细胞进一步分离获得单核细胞和悬浮细胞。3.如权利要求1所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤3)具体包括:将含有8-10%自体血浆、800-1000IU/ml GM-CSF、800_1000IU/mlIL-4的X-VIVO-15?培养基或者AIM-V?培养基加入获取的单核细胞中，继续培养；培养2_3天后，更换新鲜培养基，并在新鲜培养基中加入I~20 μ g/ml的肿瘤抗原，继续培养；培养1-2 天后，加入 IL-1 P、IL-6、TNF-α，或者 IL-1 P、IL-6、TNF-α 与 Mtb-HAg 及 IFN-Y 中的一种或者两种的组合；继续培养1-2天，进行DC成熟度和IL-12含量检测。4.如权利要求1所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤4)具体包括:将步骤2)中收集的悬浮细胞重悬于含8-10%自体灭活血浆的ΡΑΑ?或者GT-T551?等商品化无血清培养基中，调整细胞密度(1_2) X 106/ml左右，并加入IFN-Y至终浓度500-1500IU/ml，最后转移入培养瓶内进行培养；培养20-28小时后加入抗CD3单...

【专利技术属性】
技术研发人员：马飞，李龙云，李正成，
申请(专利权)人：深圳市合一康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：