一种发光细菌冻干制剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种发光细菌冻干制剂的制备方法，具体地，包括步骤：a.提供一含发光细菌和保护剂的液态混合物；b.将所述的混合物降温至第一温度区间T1并在第一温度区间维持一段时间P1；c.将所述降温后的混合物从第一温度区间T1升温至第二温度区间T2，并在第二温度区间维持一段时间P2；d.将所述的升温后的混合物升温从第二温度区间上升至第三温度区间T3,并维持一段时间P3；和e.将所述的休眠混合物进行干燥，从而形成发光细菌的冻干制剂。本发明专利技术方法制备的发光细菌冻干制剂稳定性高，复苏后的活性有效时间长。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物制剂领域，具体地，涉及发光细菌尤其是青海弧菌（Vibrio qinghaiensis)的冻干制剂领域。
技术介绍
利用发光细菌对于毒物的敏感性，进行测试和评价环境或食品的综合急性毒性已 成为越来越常用的监测方法。 在利用发光细菌测试毒物毒性的技术测试和评价环境或食品的综合急性毒性过 程中，通常使用发光细菌培养液或发光细菌冷冻干燥试剂。 发光细菌的培养液与冷冻干燥试剂相比，培养液使用复杂，需要先将发光细菌进 行固体斜面培养基培养，培养过程往往需要反复操作多次，发光细菌培养液稳定性和一致 性差，对培养时间和环境以及专业人员要求高。 目前，发光细菌冻干制剂相比培养液而言，虽然具有携带方便、操作简单的优点， 但由于复苏后的冻干细菌有效性保持时间较短，仅1小时左右，并不能满足长时间的测试 需求。 因此，本领域迫切需要开发一种稳定性高且能在复苏后长时间有效的冻干制剂。
技术实现思路
本专利技术提供了，以及一种包括本专利技术发光细 菌冻干制剂的试剂盒。 本专利技术的第一方面，提供了发光细菌冻干制剂的制备方法，包括步骤： a.提供一含发光细菌和保护剂的液态混合物； b.将所述的混合物降温至第一温度区间Tl并在第一温度区间维持一段时间 P1，从而形成降温后的混合物，其中所述的第一温度区间Tl为-100?-60°c，更佳地 为-90?-70°C ;P1为0. 2?10小时，较佳地，为0. 5?8小时，更佳地，为1?4小时； C.将所述降温后的混合物从第一温度区间Tl升温至第二温度区间T2,并 在第二温度区间维持一段时间P2,从而形成升温后混合物，所述的第二温度区间T2 为-55?-30°C，更佳地为-40?-35°C ;P2为0. 2?24小时，更佳地，为0. 5?10小时； d.将所述的升温后的混合物升温从第二温度区间上升至第三温度区间T3,并维 持一段时间P3,从而形成休眠混合物，所述的第三温度区间T3为-5?0°C，且P3为1?72 小时，更佳地，维持5?24小时；和 e.将所述的休眠混合物进行干燥，从而形成发光细菌的冻干制剂。 在另一优选例中，在步骤b中，所述的降温是将0?40°C液态混合物降至第一温度 区间T1。 在另一优选例中，在步骤b中，所述的降温速率为1_5°C /min。 在另一优选例中，在步骤b中，所述的降温时间为0. 25 - 2小时。 在另一优选例中，步骤d中还包括步骤：将所述升温后的混合物分阶段升温至所 述的第三温度区间T3。 在另一优选例中，所述的分阶段包括分为一阶段、两阶段或三阶段。 在另一优选例中，包括将所述的混合物升温至一个或多个亚温度区间S，所述的亚 温度区间选自下组：-25±2°C、-20±2°C、-15±2°C、-10±2°C。 在另一优选例中，在各亚温度区间的维持时间Ps为5?60min，更佳地，为10? 30min〇 在另一优选例中，所述的分阶段为两阶段，每阶段升温速率为rc /min，每阶段维 持时间为15分钟。 在另一优选例中，所述升温的速率为2-10°C /min。 较佳地，所述升温的速率为3-8°C /min。 在另一优选例中，所述方法还具有选自下组的一个或多个特征： ?从第一温度区间Tl升温至第二温度区间T2的升温速率为1-6°C /min ; ?从第一温度区间Tl升温至第二温度区间T2的升温时间为5-30分钟； ?从第二温度区间T2升温至第三温度区间T3的升温速率为1_6°C /min ; ?从第二温度区间T2升温至第三温度区间T3的升温时间为5-30分钟； 在另一优选例中，所述的发光细菌是选自以下属的发光细菌：弧菌属（Vibrio)、 发光杆菌属（Photobacterium)、光杆菌属（Photorhabdus)。 在另一优选例中,所述的发光细菌是青海弧菌或其衍生菌。 在另一优选例中，所述的发光细菌是来自发光杆菌属的明亮发光杆菌。 在另一优选例中，所述的发光细菌是来自弧菌属的费氏弧菌（Vibrio fischeri)。 在另一优选例中，步骤a中所述的保护剂包括奶粉、海藻糖 步骤e中，所述的干燥为真空干燥。 本专利技术的第二方面，提供了一种发光细菌的冻干制剂，所述的冻干制剂经复苏后， 发光细菌的存活半衰期T 1/2 > 4小时。 在另一优选例中，Τ1/2为5_10小时。 在另一优选例中，Τ1/2彡5小时，Τ1/2彡6小时，Τ 1/2彡7小时，Τ1/2彡8小时，Τ1/2彡10 小时， 本专利技术的第三方面，提供了一种发光细菌的冻干制剂，所述的冻干制剂中发光细 菌的发光计数值在40万光子数以上。 在另一优选例中，所述的发光计数值为按ISO标准ISOl 1348-3-2007所述方法，于 冻干制剂复苏后15分钟时测定值（Ikl5或Ic15)。 在另一优选例中，发光计数值> 50万光子数、> 60万光子数、或> 70万光子数。 在另一优选例中，所述的冻干制剂是由本专利技术第一方面中任一所述的方法制备。 本专利技术的第四方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括容器以及位于所述容 器中的权利要求7或8所述的冻干制剂。 在另一优选例中，所述的试剂盒还包括使用说明书和任选的一种或多种选自下组 的任选试剂： (a)复苏液或复苏试剂； (b)检测试剂； 在另一优选例中，所述的复苏液包括0. 85%氯化钠溶液 在另一优选例中，所述的冻干制剂和任选试剂是独立包装的。 本专利技术的第五方面，提供了一种检测方法，所述的方法包括步骤： i)将本专利技术第二或第三方面所述的发光细菌的冻干制剂复苏，形成复苏后的发光 细菌的菌液； ii)将所述的发光细菌的菌液与待测物进行接触，从而通过测定发光细菌的发光 强度来定性或定量检测待测物中的毒物。 在另一优选例中，所述的待测物包括水样。 在另一优选例中，所述的毒物包括重金属、农药、有机化合物等。 在另一优选例中，所述的复苏步骤包括将所述冻干制剂与复苏液混合，从而并形 成复苏后的发光细菌的菌液，并在室温（10?40°C )下放置一段时间（如0. 5?2小时）。 在另一优选例中，所述方法还包括步骤：测定复苏后的发光细菌的初始发光强度。 应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。 【附图说明】 图1显示了实施例1中，制备青海弧菌冻干制剂的温度曲线。 图2是本专利技术试剂做空白对照液测试数据的结果图。可以发现本专利技术试剂的发光 抑制率一直平稳保持到90分钟后，没有明显的下降趋势。 图3是使用本专利技术试剂做参比毒物氯化锌样品测试数据的结果图。可以发现本发 明试剂的发光抑制率一直平稳保持到22小时后，没有明显的下降趋势。 图4使用H试剂做的空白对照液测试数据的结果图。可以发现H试剂的发光抑制 率在60分钟后有急剧下降的趋势。 【具体实施方式】 本专利技术人经过广泛而深本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发光细菌冻干制剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：a.提供一含发光细菌和保护剂的液态混合物；b.将所述的混合物降温至第一温度区间T1并在第一温度区间维持一段时间P1，从而形成降温后的混合物，其中所述的第一温度区间T1为‑100～‑60℃；P1为0.2～10小时；c.将所述降温后的混合物从第一温度区间T1升温至第二温度区间T2，并在第二温度区间维持一段时间P2，从而形成升温后混合物，所述的第二温度区间T2为‑55～‑30℃；P2为0.2～24小时；d.将所述的升温后的混合物升温从第二温度区间上升至第三温度区间T3,并维持一段时间P3，从而形成休眠混合物，所述的第三温度区间T3为‑5～0℃，且P3为1～72小时；和e.将所述的休眠混合物进行干燥，从而形成发光细菌的冻干制剂。

【技术特征摘要】
1. 一种发光细菌冻干制剂的制备方法，其特征在于，包括步骤： a. 提供一含发光细菌和保护剂的液态混合物； b. 将所述的混合物降温至第一温度区间T1并在第一温度区间维持一段时间P1，从而 形成降温后的混合物，其中所述的第一温度区间T1为-100?-60°C;P1为0. 2?10小时； c. 将所述降温后的混合物从第一温度区间T1升温至第二温度区间T2,并在第二温度 区间维持一段时间P2,从而形成升温后混合物，所述的第二温度区间T2为-55?-30°C;P2 为0. 2?24小时； d. 将所述的升温后的混合物升温从第二温度区间上升至第三温度区间T3,并维持一 段时间P3,从而形成休眠混合物，所述的第三温度区间T3为-5?0°C，且P3为1?72小 时；和 e. 将所述的休眠混合物进行干燥，从而形成发光细菌的冻干制剂。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤d中还包括步骤：将所述升温后的混合 物分阶段升温至所述的第三温度区间T3。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的分阶段包括分为一阶段、两阶段或三 阶段。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述升温的速率为2-10°C /min，...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾立波，陈连康，张玉荣，丁国荣，王菁，
申请(专利权)人：上海市刑事科学技术研究院，上海安力康科学仪器有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31