一种姬松茸菌种液氮保藏方法技术

本发明专利技术属于姬松茸领域，更涉及一种姬松茸菌种液氮保藏的方法。该方法通过将姬松茸接种于M3培养基培养，10~12wt%甘油作为姬松茸菌种液氮保藏的保护剂，采用如下降温程序：在常温下以4℃/min降至4℃，再以1℃/min降到-40℃，后放入液氮罐中保存，30℃恒温水浴锅解冻。本发明专利技术申请人从培养基筛选、培养基条件、液氮降温程序等因素进行优化，寻找一种适合姬松茸菌种液氮保藏的方法，为姬松茸的科学研究与生产应用提供菌种保障。姬松茸菌种在这种保藏方法下，存活率达100%，且生长速度快，菌丝生长旺盛，其活力也高，不易发生变异，可长期保藏，避免为保持其存活需要定期转接而发生菌种污染、活力降低等不利因素。

【技术实现步骤摘要】
一种姬松茸菌种液氮保藏方法
本专利技术属于姬松茸领域，更涉及一种姬松茸菌种液氮保藏的方法。
技术介绍
姬松茸Agaricusblazeimurrill又名小松菇、柏氏蘑菇、巴西蘑菇，原分布于北美洲南部和南美洲北部部分地区，1965年，日裔巴西人将这种美味食用菌引入日本，日本岩出亥之助教授将其取名为姬松茸。姬松茸是一种夏秋生长的腐生菌，生活在高温、多湿、通风的环境中，具杏仁香味，口感脆嫩。姬松茸菌盖嫩，菌柄脆，口感极好，味纯鲜香，食用价值颇高，且营养价值也很高。姬松茸具有很高的药用价值，含有多种生理活性物质，如多糖、糖蛋白、核酸、脂质、甾醇类物质。因姬松茸属于高温型菌类，其菌种在低温下不易保藏，在我们前期的试验中，发现其菌种在4～10℃冰箱保存至12d，菌种出现死亡，这将严重影响姬松茸的科学研究与生产应用。菌种保藏的目的是使所需保藏的菌种保持生物活力，不衰退，不污染杂菌，不发生变异，尽可能接近原始菌株的状态。已有的研究表明，用液氮超低温保存菌种已被公认为保持菌种特性不变和存活力持久最为理想的方法。鉴于姬松茸菌种在低温下不易存活，而液氮超低温保存是一种比较理想的保藏方法的矛盾下，本专利技术申请人从培养基筛选、培养基条件、液氮降温程序等因素进行优化，寻找一种适合姬松茸菌种液氮保藏的方法，为姬松茸的科学研究与生产应用提供菌种保障。
技术实现思路
鉴于上述背景，本专利技术提供了一种姬松茸菌种液氮保藏方法。本专利技术采取的技术方案如下：本专利技术的姬松茸菌种液氮保藏方法包括以下步骤：（1）将姬松茸接种于M3培养基，正面放置于27～30℃恒温生化培养箱，培养8～10d；（2）在无菌操作环境下，取新鲜菌块于灭菌的安培管，注入灭菌过的10~12wt%甘油，没过菌块，常温静置2.5～3.0h；（3）把安培管放入程序降温仪，采用如下降温程序：在常温下以4℃/min降至4℃，再以1℃/min降到-40℃，后放入液氮罐中保存；（4）启用液氮罐中保存的菌种时，将安培管迅速从液氮罐中取出，放入30℃恒温水浴锅，解冻5min，接种于M3培养基。所述M3培养基：马铃薯150～180g/L，玉米粉75～100g/L，蔗糖18～20g/L，蛋白胨2.0～3.0g/L，KH2PO41.8～2.0g/L，MgSO40.8～1.0g/L，VB110mg/L，琼脂条23～25g/L，pH值自然；M3培养基的配制：将马铃薯去皮切成小块，加1L的蒸馏水，煮沸浸提，过滤，取滤液，接着加入玉米粉，煮沸浸提，过滤，取滤液，再加入琼脂条溶解，最后加入蔗糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、VB1溶解，用蒸馏水补足至1L。本专利技术具有以下优点：1、筛选到一种适合姬松茸菌种培养的培养基，与常规真菌PDA培养基相比，姬松茸菌种在这种培养基上生长速度快，长势均匀，菌丝浓密。2、解决了姬松茸菌种在低温保藏下不易存活的问题。3、获得了一套适合姬松茸菌种液氮保藏的方法，姬松茸菌种在这种保藏方法下，存活率达100%，且生长速度快，菌丝生长旺盛，其活力也高，不易发生变异，可长期保藏，避免为保持其存活需要定期转接而发生菌种污染、活力降低等不利因素。附图说明图1为姬松茸AbML11在PDA培养基上正面放置培养；图2为姬松茸AbML11在PDA培养基上倒置培养；图3为姬松茸AbML11在M1培养基上正面放置培养；图4为姬松茸AbML11在M1培养基上倒置培养；图5为姬松茸AbML11在M2培养基上正面放置培养；图6为姬松茸AbML11在M2培养基上倒置培养；图7为姬松茸AbML11在M3培养基上正面放置培养；图8为姬松茸AbML11在M3培养基上倒置培养；图9为姬松茸AbML11在M4培养基上正面放置培养；图10为姬松茸AbML11在M4培养基上倒置培养。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的阐述。实施例1：姬松茸菌种在4℃冰箱保藏期限1、试验菌株姬松茸菌种选用福建省认定的姬松茸品种姬松茸AbML11，由福建省农业科学院土壤肥料研究所提供。2、姬松茸菌种低温保藏期限把培养好的姬松茸菌种放入4℃冰箱保藏，从第5d开始每天从冰箱中取出试管转接，看其萌发情况。结果，从第5d开始至第11d，姬松茸AbML11均能正常萌发，到第12d未见萌，第13d至15d也没有萌发，即死亡。因此姬松茸AbML11在4℃冰箱保藏的保藏期限是11d，说明姬松茸菌种在低温条件下不易保存。实施例2：姬松茸菌种培养基筛选及培养放置3、不同培养基对姬松茸菌种生长影响设计下列4种培养基，以PDA培养基为参照，察看培养基对姬松茸菌种生长的影响，4种设计的培养基及参照培养基PDA培养基配方如下：PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1L。M1培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨2.0g,，KH2PO42.0g，MgSO41.0g，VB110mg，琼脂条20g，蒸馏水1L，pH值自然。M2培养基：马铃薯150，玉米粉100g，蔗糖20g，KH2PO42.0g，MgSO41.0g，VB110mg，琼脂条25g，蒸馏水1L，pH值自然。M3培养基：马铃薯150，玉米粉100g，蔗糖20g，蛋白胨2.0g，KH2PO42.0g，MgSO41.0g，VB110mg，琼脂条25g，蒸馏水1L，pH值自然。M4培养基：马铃薯150，葡萄糖20g，木屑100g，蛋白胨2.0g,，KH2PO42.0g，MgSO41.0g，VB110mg，琼脂条25g，蒸馏水1L，pH值自然。将姬松茸菌种接于PDA培养基、M1培养基、M2培养基、M3培养基、M4培养基，于30℃恒温培养箱培养8d。结果，姬松茸菌种在M3培养基上长势最旺盛，生长速度最快、边缘整齐、菌丝最浓密；其次是M2培养基上，接着是PDA培养基，M1培养基较差，姬松茸菌种在M4培养基上长势最差。因此选择M3培养基作为姬松茸菌种生长的培养基。4、培养放置对姬松茸菌种生长影响将姬松茸菌种接于PDA培养基、M1培养基、M2培养基、M3培养基、M4培养基，分别正面放置培养及倒置培养，观察培养放置对姬松茸菌种生长影响，结果在PDA培养基、M1培养基、M2培养基、M3培养基和M4培养基上，姬松茸菌种正面放置培养的长势等均优于倒置培养，倒置培养时菌丝稀拉，成绒毛状，生长不正常。因而培养姬松茸菌种时采用正面放置。实施例3：液氮保藏条件对姬松茸菌种保藏影响5、不同培养基培养姬松茸菌种对保藏影响将姬松茸菌种分别接种于PDA培养基、M1培养基、M2培养基、M3培养基、M4培养基，30℃培养8d，取同一培养状态的姬松茸菌种0.5cm方块大小于灭菌过的安培管，注入10%灭菌过的甘油没过菌块，室温放置3h后，按表1的处理5方法进行降温处理。结果，M3培养基培养的姬松茸菌种的萌发时间最快，菌丝最浓密，生长速度也最快，表明培养基对姬松茸菌种的液氮保藏有影响。6、降温处理对姬松茸菌种保藏影响在姬松茸菌种放入液氮之前，设计以下11个处理，观察不同处理对姬松茸菌种的影响。取同一培养状态的姬松茸菌种0.5cm方块大小于灭菌过的安培管，注入10%灭菌过的甘油没过菌块，室温放置3h后，按表1的方法进行降温处理。结果处理1、处理5、处理8的姬松茸菌种存活率达100%，但处理5的姬松茸萌发时间最快，2d即可萌发，菌种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种姬松茸菌种液氮保藏方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）将姬松茸接种于M3培养基，正面放置于27～30℃恒温生化培养箱，培养8～10d；（2）在无菌操作环境下，取新鲜菌块于灭菌的安培管，注入灭菌过的10‑12wt%甘油，没过菌块，常温静置2.5～3.0h；（3）把安培管放入程序降温仪，采用如下降温程序：在常温下以4℃/min降至4℃，再以1℃/min降到‑40℃，后放入液氮罐中保存；（4）启用液氮罐中保存的菌种时，将安培管迅速从液氮罐中取出，放入30℃恒温水浴锅，解冻5min，接种于M3培养基。

【技术特征摘要】
1.一种姬松茸菌种液氮保藏方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）将姬松茸接种于M3培养基，正面放置于27～30℃恒温生化培养箱，培养8～10d；（2）在无菌操作环境下，取新鲜菌块于灭菌的安培管，注入灭菌过的10~12wt%甘油，没过菌块，常温静置2.5～3.0h；（3）把安培管放入程序降温仪，采用如下降温程序：在常温下以4℃/min降至4℃，再以1℃/min降到-40℃，后放入液氮罐中保存；（4）启用液氮罐中保存的菌种时，将安培管迅速从液氮罐中取出，放入30℃恒温水浴锅，解冻5m...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘新锐，谢宝贵，邓优锦，江玉姬，朱坚，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35