一种猪萎缩性鼻炎灭活疫苗攻毒效检方法技术

本发明专利技术提供了一种猪萎缩性鼻炎灭活疫苗攻毒效检方法，该方法包括：产毒素巴氏杆菌攻毒剂量的确定步骤，以及对仔猪免疫后攻毒效检步骤。该方法不仅解决了不同毒力多杀性巴氏杆菌细菌造成攻毒剂量无法准确判断的问题，还有效解决了仔猪免疫猪萎缩性鼻炎灭活疫苗后免疫效果评价的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种疫苗攻毒效检方法。
技术介绍
猪萎缩性鼻炎（atrophic rhinitis,AR）是猪群的一种重要的呼吸系统传染病，它会引起猪的慢性鼻炎、打喷嚏、流眼泪、颜部变性和鼻甲骨萎缩等症状，严重的还可以导致鼻吻变形并影响全身骨骼发育，从而导致猪生长迟缓，使猪容易感染继发性复合性肺炎，给养猪业造成巨大的损失。该病可感染任何年龄阶段的猪，其中4周龄以内的猪感染率最高，症状一般出现在8-12周龄。猪萎缩性鼻炎通常是由支气管败血波氏杆菌（Bb）和多杀性巴氏杆菌（Pm）共同导致。其中，支气管败血波氏杆菌血清型单一，毒力相对稳定，在萎缩性鼻炎病变中起打开鼻粘膜门户的作用，进而让巴氏杆菌进入猪体内，造成萎缩性鼻炎的发生。疫苗免疫是预防猪进行性萎缩性鼻炎有效的方法，现有的猪萎缩性鼻炎疫苗效检方法为攻毒效检和替代动物测定抗体，其中攻毒效检方法为免疫母猪对仔猪攻毒法，具体为含有支气管败血波氏杆菌（Bb）和多杀性巴氏杆菌（Pm）抗原成分的猪萎缩性鼻炎疫苗攻毒免疫母猪，同时设置未免疫母猪对照组，免疫母猪所产仔猪连同未免疫母猪所产仔猪7日龄先Bb攻毒，10日龄进行Pm攻毒，42日龄处理仔猪观察结果。但尚未有用含有支气管败血波氏杆菌（Bb）和多杀性巴氏杆菌（Pm）抗原成分的猪萎缩性鼻炎疫苗免疫仔猪后，来检测攻毒效检的方法。并且，不同来源的多杀性巴氏杆菌菌株毒力也不完全相同，加上血清型众多，造成了在攻毒效检时无法准确的判断出攻毒的剂量，以致于攻毒效检失败，攻毒模型无法建立，进而无法准确判断出疫苗的效力。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种猪萎缩性鼻炎灭活疫苗攻毒效检方法，所述方法不仅解决了不同毒力多杀性巴氏杆菌细菌造成攻毒剂量无法准确判断的问题，还有效解决了仔猪免疫猪萎缩性鼻炎灭活疫苗后免疫效果评价的问题。本专利技术的主要目的在于提供一种猪萎缩性鼻炎灭活疫苗攻毒效检方法，所述方法包括：产毒素巴氏杆菌攻毒剂量的确定步骤，以及对仔猪免疫后攻毒效检步骤。优选地，所述方法进一步包括攻毒菌毒液的制备步骤，所述攻毒菌毒液的制备步骤包括将支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌菌种分别于固体培养基平面活化，分别挑取所述支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌单克隆于培养基培养，收获菌液；对所述支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌菌液细菌计数，确定菌液活菌含量。更优选地，所述支气管败血波氏杆菌为支气管败血波氏杆菌HN8株，所述多杀性巴氏杆菌为多杀性巴氏杆菌D型HB4株。支气管败血波氏杆菌HN8株（Bordetella bronchiseptica HN8）保藏号为：CCTCC NO.M2011223，多杀性巴氏杆菌D型HB4株（Pasteurella multocida D Type HB4）保藏号为：CCTCC NO.M2011221，保藏日期均为2011年06月28日，保藏地址均为：中国武汉，武汉大学；保藏单位均为中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC）。更优选地，所述培养支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌单克隆菌株的培养基为固体培养基。使用本专利技术攻毒菌毒液的制备方法进行菌液的培养，预估出的活菌含量准确性更高，对定量攻毒剂量的准确性有很大的提升。优选地，所述多杀性巴氏杆菌攻毒剂量的确定步骤包括通过多杀性巴氏杆菌对小鼠半数致死量确定多杀性巴氏杆菌对仔猪每鼻孔攻毒剂量。更优选地，其中所述多杀性巴氏杆菌对仔猪每鼻孔攻毒剂量/多杀性巴氏杆菌对小鼠半数致死量为1～2×103～1～2×104。优选地，所述对仔猪免疫后攻毒效检步骤包括：在免疫组仔猪免疫二免后用支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏菌病毒混合液连同攻毒对照组仔猪进行鼻内攻毒，两个鼻孔同时攻毒；最后一次攻毒后35日解剖仔猪，对仔猪鼻甲骨萎缩情况进行评分，攻毒对照组至少80%仔猪鼻甲骨萎缩分数在8分及以上，免疫组仔猪鼻甲骨萎缩平均分数比攻毒对照组仔猪鼻甲骨萎缩平均分数统计学上显著降低。所述统计学上显著降低为免疫组仔猪鼻甲骨萎缩平均分数比攻毒对照组仔猪鼻甲骨萎缩得分通过统计学分析，P<0.05，差异显著。更优选地，所述仔猪免疫二免后第21天、第24天和第25天连续攻毒。更优选地，所述攻毒菌液中含猪支气管败血波氏杆菌HN8株2.05×109CFU/鼻孔，含多杀性巴氏杆菌D型HB4株2.2×109～2.2×1010CFU/鼻孔。更优选地，所述仔猪7-10日龄首免，首免后14天进行二免。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。本专利技术实施例以支气管败血波氏杆菌HN8株、多杀性巴氏杆菌LFB3株、P-2237株和HB4株为例说明本专利技术。实施例1、不同毒力的多杀性巴氏杆菌攻毒剂量的确定1方法1.1菌种支气管败血波氏杆菌HN8株（Bordetella bronchiseptica HN8）保藏号为：CCTCC NO.M2011223，多杀性巴氏杆菌D型HB4株（Pasteurella multocida D Type HB4）保藏号为：CCTCC NO.M2011221，保藏日期均为2011年06月28日，保藏地址均为：中国武汉，武汉大学；保藏单位均为中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC）。多杀性巴氏杆菌LFB3株来自J.M.Rutter博士(Compton,UK)，公开于Evaluation of vaccines for atrophic rhinitis—a comparison of three challenge models（Vaccine20(2002)1797–1802，T.Magyar等），多杀性巴氏杆菌P-2237株公开于产毒素多杀性巴氏杆菌的鉴定（中国畜牧兽医，2010，37(1):149-151；李伟杰等）。1.2攻毒菌毒液的制备将保存的支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌菌种划线于TSA（含10%鸡血清）平板37℃培养16h，用BHI（10%甘油）洗下后混匀分装成5ml/瓶，保存于-70℃，融化后回复计数计算每瓶冻干菌活菌数（重复回复计数三次取平均数）。按照实验方案调整菌液浓度为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪萎缩性鼻炎灭活疫苗攻毒效检方法，所述方法包括：产毒素巴氏杆菌攻毒剂量的确定步骤，以及对仔猪免疫后攻毒效检步骤。

【技术特征摘要】
1.一种猪萎缩性鼻炎灭活疫苗攻毒效检方法，所述方法包括：产
毒素巴氏杆菌攻毒剂量的确定步骤，以及对仔猪免疫后攻毒效检步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括攻毒
菌毒液的制备步骤，所述攻毒菌毒液的制备步骤包括将支气管败血波氏
杆菌和多杀性巴氏杆菌菌种分别于固体培养基平面活化，分别挑取所述
支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌单克隆于培养基培养，收获菌
液；对所述支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌菌液细菌计数，确定
菌液活菌含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述支气管败血波氏杆菌
为支气管败血波氏杆菌HN8株，所述多杀性巴氏杆菌为多杀性巴氏杆
菌D型HB4株。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述培养支气管败血波氏
杆菌和多杀性巴氏杆菌单克隆菌株的培养基为固体培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多杀性巴氏杆菌攻毒
剂量的确定步骤包括通过多杀性巴氏杆菌对小鼠半数致死量确定多杀
性巴氏杆菌对仔猪每鼻孔攻毒剂量。
6.根据权利要求5所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张许科，孙进忠，田克恭，
申请(专利权)人：普莱柯生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41