【技术实现步骤摘要】
hTERT及SV40LT联合介导构建猫叫综合征细胞模型及其细胞库
本专利技术涉及hTERT (端粒酶逆转录酶催化亚基)及SV40LT (猴肾病毒40大T抗原基因)联合介导构建猫叫综合征细胞模型及其细胞库，主要用于生殖健康研究领域，为染色体缺失猫叫综合征的体外研究提供细胞模型并保存其科研资源。
技术介绍
染色体缺失猫叫综合征又称cri一du一chat综合征，是1963年法国科学家首先报告的一种特殊疾病。小儿猫叫综合征是5号染色体短臂缺失所引起的，而且多数缺失是两次断裂的结果，从理论上染色体部分缺失的原因至少有4种:末端缺失、中间缺失、易位和短臂内的不等互换，有人发现缺失部分均有5pl4，因此5pl4被认为是猫叫综合征的特征区。从染色体的变化来看，第5号染色体的短臂上有发音的遗传基因，当此处缺失时，可发生发音音调的变异。 猫叫综合征的临床表现是病儿出生时平均体重低于2500g，身长低于正常儿，平均头围31cm。生长障碍，最显著的特征为婴儿期有微弱的、悲哀的、咪咪似猫叫的哭声，此种哭声在呼气时发生，吸气时不出现。典型哭声常在幼儿早期逐渐消失，但...
【技术保护点】
一种用于医学领域的hTERT及SV40LT联合介导构建猫叫综合征细胞模型及其细胞库的方法，其主要特征是以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体pcDNA3.1(‑)DNA的产物，构建SV40LT—pcDNA3.1(‑)重组子；并以Ligation Mix连接经EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo—hTERT和载体pLXSNneo的产物，构建pLXSNneo—hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后以脂质体转染导入染色体缺失猫叫综合征组织细胞，经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆并扩大培养，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、...
【技术特征摘要】
1.一种用于医学领域的hTERT及SV40LT联合介导构建猫叫综合征细胞模型及其细胞库的方法，其主要特征是以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体pcDNA3.1 (-)DNA 的产物，构建 SV40LT — pcDNA3.1 (-)重组子；并以 Ligat1n Mix 连接经EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo — hTERT和载体pLXSNneo的产物，构建pLXSNneo—hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后以脂质体转染导入染色体缺失猫叫综合征组织细胞，经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆并扩大培养，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达产物、免疫组织化学染色、细胞增殖周期及细胞凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT联合介导染色体缺失猫叫综合征体外研究细胞模型冻存于液氮中，为从细胞水平(替代人体或动物直接试验)在体外长期研究其发病机制奠定基础。2.根据权利要求1所述的hTERT及SV40LT联合介导构建猫叫综合征细胞模型及其细胞库的方法，其特征是所指细胞模型为(I)细胞在倒置光学显微镜下呈梭形或小园形的上皮细胞样贴壁生长；(2)细胞的生长曲线如以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴，在hepatoZYME-SFM无血清培养基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)染色体核型为“46，XX (XY)，5P_”，即染色体数目为46条(二倍体)，并具有5号染色体短臂缺失；(4)细胞不能在软琼脂内生长(形成克隆)；(5)细胞为非恶化细胞，裸鼠致瘤试验阴性；(6)细胞的DNA中同时整合了SV40LT和hTERT基因，同时表达SV40LT和hTERT基因的mRNA产物；(7)细胞传代至第175代、培养至第12天时，呈对数生长、圆形、梭形、铺满瓶底，其细胞生长汇合率达86%以上，此后随着传代次数的增加，细胞生长变慢、变稀疏。(8)作为细胞模型用于在体外从细胞水平研究染色体缺失猫叫综合征的发病机制、遗传资源贮存、实验对照及质控细胞。3.根据权利要求1所述的hTERT及SV40LT联合介导构建猫叫综合征细胞模型及其细胞库的方法，其特征是取自因其他实验所需而采集的、并在其他实验后多余、废弃的染色体缺失猫叫综合...
【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，朱依敏，沈国松，金帆，毛愉婵，杨燕梅，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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