本发明专利技术属于转基因动物模型的构建技术领域，具体涉及一种快速获得多种抗性的转基因小鼠方法，在构建pInsulator4X-CAG-PHBN载体后，将pInsulator4X-CAG-PHBN载体与pInsulator4X-CAG载体分别用限制性内切酶SwaI线性化、酚氯仿抽提、乙醇沉淀之后进行HEK293细胞的转染，再将pInsulator4X-CAG-PHBN载体原核注射，得到同时具有四种抗性的转基因小鼠。利用一次打靶获得具有四种抗性的转基因小鼠。通过该方法得到的小鼠只需要维持这一个小鼠品系既可以获得四种抗性的MEF，应用2A肽创造了获得多种抗性的转基因小鼠新方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于转基因动物模型的构建
，具体涉及一种快速获得多种抗性的转基因小鼠及多种抗性的腿？。
技术介绍
自1980年第一只转基因小鼠诞生以来，转基因技术得到了迅猛的发展。转基因小鼠模型目前已经成为基因功能研究的一个最重要工具。基因打靶技术作为诸多转基因小鼠制备方法中的一种，倍受研究者的青睐。它是基于同源重组的原理，定点敲除、敲入或者进行基因的突变而对小鼠的内源基因进行改造。基因打靶的受体细胞是胚胎干细胞，胚胎干细胞的培养通常需要小鼠胚胎成纤维细胞(101186 ￡111131-701110腿？)来作为滋养层细胞。基因打靶之后需要抗性药物的筛选才能获得阳性克隆，尤其是近来研究者热衷于一株干细胞的多基因连续打靶，这就需要两种或者多种抗性的12？来满足实验需求。目前商品化的4种抗性的腿？是从了％匕011实验室0卜4小鼠中分离的。0卜4小鼠是将4个转基因位点全部配成纯和来维系的，且抗性表达不高。因此，传统获得多种抗性转基因小鼠的方法已经不能满足研究的要求。 转基因动物￡11111118118 )是通过人工的方法，将外源基因导入动物基因组内使之与动物基因组整合稳定表达并遗传给后代的动物⑴。目前已经成功制备了很多转基因动物，比如:牛、羊、鸡、猪、鱼、兔、鼠、果蝇等。转基因技术首先是在小鼠上建立起来的，也因此小鼠成为生命科学发展的一个很得力的动物模型。自1980年第一只转基因小鼠诞生以来，很多研究者纷纷开展转基因小鼠研究工作，转基因小鼠的制备方法由最开始的原核注射到如今已经产生了很多种制备转基因小鼠的方法。但是目前制备转基因小鼠模型主要有两种基本方法:一种是转基因，另一种是基因打靶。 转基因是将外源基因引入小鼠基因组内。主要有原核注射法、逆转录病毒侵染法(慢病毒侵染法)以及胚胎干细胞法。这3种方法可以实现将外源基因转移到小鼠基因组内。原核注射法是直接将克隆的载体通过显微注射的方法注射到小鼠的受精卵原核中，实现克隆基因的整合表达。这是非常经典的一种转基因方法。它的优点是可以有效的注射大小可达几个1?到几百个1?的外源0嫩片段，而且可以有效的整合到小鼠的基因组中。当然，它的缺点毋庸置疑就是原核注射法它的效率不高，一般需注射500-600个受精卵才能得到3-4个首建鼠，甚至得不到。即使有了首建鼠，即外源基因已经整合到小鼠的基因组内，但是往往就会出现转基因小鼠在后期不表达。另一种是逆转录病毒侵染法，它可以通过侵染小鼠着床前胚胎细胞或者着床后胚胎细胞，将外援的0嫩转移到小鼠基因组中。随后的研究发现，很多通过逆转录病毒侵染法得到的转基因小鼠的转基因片段因发生甲基化而不表达。慢病毒因克服了基因沉默而优于逆转录病毒，但慢病毒载体侵染法对外源0嫩片段的大小有限制而且整合的外源基因不是集中分布的，所以我们不能通过慢病毒载体侵染法在基因组的某个部位插入多个拷贝的外源基因实现转基因的高表达。还有一种方法是胚胎干细胞法，也被称为是￡3细胞介导的转基因。这一技术是建立在胚胎干细胞技术的基础之上的。胚胎干细胞法有很多优点，如它可以在载体构建的时候引入一个正筛选标记基因，在细胞转染之后可以在培养皿中筛选得到外源基因表达量高的细胞株。而且￡3细胞介导的转基因倾向于单拷贝整合，那么可以在几百个克隆中选出单拷贝、普遍高表达的转基因￡8细胞系。将这些细胞株注射到小鼠囊胚中，得到嵌合体再传代极有可能是外源基因表达量高的转基因小鼠。一定程度上减少了通过原核注射得到的转基因小鼠，在后期对首建鼠(^(161-)转基因表达高低筛选的工作量。胚胎干细胞法在载体的构建上还可以引入报告基因、1似？等位点，使得￡3细胞介导的转基因可以在时空表达上受到一定的控制。胚胎干细胞法也有缺点，它在技术上要求更高。比如通过这种方法制备的转基因一定是在￡3细胞培养技术上相当熟练，因为￡3细胞在培养的过程中很容易因细胞分化而失去了全能性。 基因打靶是利用同源重组的方法改变小鼠的内源基因⑽。基因打靶也被称为“基因敲除”。小鼠细胞基因组中的一段0嫩序列被称为“靶子”，与要引入的外源基因0嫩序列被称为“弹头”进行准确的定点整合。因而就需要在弹头的两端设计与靶子两侧一样的0嫩序列，称为同源臂。打靶载体含有一段同源区段、外源基因、阳性筛选基因(一般是新霉素抗性基因?、一段同源区段以及负选择标志(一般是单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶-让)基因序列这些是一个经典的基因打靶载体所需元件。在1989年，(?%⑶卜丨⑽等利用类似设计的打靶载体通过￡3细胞基因打靶得到了一个基因敲除鼠。基因打靶的受体细胞一般是￡3细胞。￡3细胞是从129^小鼠见栓3.5天囊胚的内细胞团中分离而来的。￡3细胞很容易分化，所以￡3细胞的培养在基因打靶的整个事件中是一个非常关键的环节。同时这也成为了基因打靶的一个难点。￡3细胞的培养需要提供白血病抑制因子(匕业咖匕1111111311:01~71117)以及作为滋养层细胞(^66(161 0611)的小鼠胚胎成纤维细胞 (101186 ￡111131-701110 ^1131-0)31881:,)。 目前科学家们已经获得了潮霉素88 )抗性的转基因小鼠，新霉素(86011170111)抗性的转基因小鼠，嘌呤抗性的转基因小鼠和6-硫代鸟嘌呤(6-111108皿111116，6X6)抗性的转基因小鼠。这四种单一抗性的腿？转基因小鼠为基因打靶在选择阳性筛选基因时提供了很大的便利，但是事实上，分离单一抗性的12？很浪费时间和精力，同时还得维持这几种小鼠品系。而且很多基因打靶实验需要的是连续的多种抗性的腿？筛选，鉴于这样实验的要求，把48011实验室利用新霉素抗性和嘌呤抗性的小鼠、潮霉素抗性的小鼠以及6X6抗性的小鼠两种两种杂交，直至纯合之后再杂交，纯合之后就是如今我们在市场上买到的08-4小鼠。08-4小鼠能表达四种抗性蛋白用来分离含有四种抗性的腿?，供胚胎干细胞基因打靶后阳性克隆的筛选所用。这是一个非常实用的想法。但是该方法在操作起来很耗时间而且需要投入很多精力。在很长的一段时间需要维持这三种小鼠的品系。然后再两种两种去配小鼠，做基因型鉴定。比如说两种小鼠纯合之后还要进行下一轮的配小鼠做鉴定。要使的三对基因纯合需要很长的时间。而且任何时候只要有一只小鼠在配的时候出现问题，可能会导致以前纯合的小鼠会发生性状的分离。而且0卜4小鼠四种抗性基因表达量没有保障。08-4小鼠远在美国，我们想做基因打靶、想做两次基因打靶、想用四种抗性的小鼠只能花钱拿到0卜4小鼠的腿？或者已经处理过的￡66(161^而腿？传代有限。迄今为止，国内尚未出现同时表达4种抗性基因的转基因小鼠。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决多种抗性转基因小鼠难以获得的问题，而提出一种快速构建表达四种抗性蛋白转基因小鼠的方法，成功构建了表达四种抗性蛋白的转基因小鼠。 本专利技术的目的是通过下述技术方案实现的: 构建完图1中所示的刚载体后，将刚载体与载体分别用限制性内切酶线性化、酹氯仿抽提、乙醇沉淀之后进行册1(293细胞的转染，最终获得图3所示的结果，结果显示？1118111社014^-0^-？！1刚载体在真核细胞中高表达四种抗生素。然后将1)1118111社载体原核注射本文档来自技高网...
【技术保护点】
表达四种抗性蛋白的转基因小鼠的构建方法，其特征是：构建pInsulator4X‑CAG‑PHBN载体后，将pInsulator4X‑CAG‑PHBN载体与pInsulator4X‑CAG载体分别用限制性内切酶SwaI线性化、酚氯仿抽提、乙醇沉淀之后进行HEK293细胞的转染，最终获得结果显示pInsulator4X‑CAG‑PHBN载体在真核细胞中高表达四种抗生素，然后将pInsulator4X‑CAG‑PHBN载体原核注射，得到转基因小鼠，通过基因型鉴定结果确认最终获得同时具有四种抗性的转基因小鼠。
【技术特征摘要】
1.表达四种抗性蛋白的转基因小鼠的构建方法，其特征是:构建PI n su I at or 4X-CAG-PHBN 载体后，将 pInsulator4X-CAG_PHBN 载体与 pInsulator4X_CAG 载体分别用限制性内切酶SwaI线性化、酚氯仿抽提、乙醇沉淀之后进行HEK293细胞的转染，最终获得结果显示pInsulator4X-CAG-PHBN载体在真核细胞中高表达四种抗生素，然后将pInsulator4X-CAG-PHBN载体原核注射，得到转基因小...
【专利技术属性】
技术研发人员：张禄卿，郑耀武，班路莹，
申请(专利权)人：东北师范大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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