本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有高抗凝活性的透明质酸衍生物的制备方法。以透明质酸为起始物，首先用化学法制备得到N-位硫酸化透明质酸，在此基础上采用3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸酯(PAPS)再生系统，以6-O-硫酸基转移酶(6-OST)和3-O-硫酸基转移酶(3-OST)对抗凝血活性特定位点进行有效的选择性硫酸化，其次用6-O-脱硫酸基酶(6-O-sulfatase)选择性去除与抗凝血活性无关的硫酸基，降低其电荷密度，合成得到具有高抗凝活性的透明质酸衍生物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种具有高抗凝活性的透明质酸衍生物的制 备方法。
技术介绍
肝素是由己糖醛酸（L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸）和D-硫酸氨基葡萄糖以1-4 糖苷键交替形成的多糖，自1935年以来，肝素作为抗凝药物已广泛应用于临床。肝素的抗 凝血活性来自于它的一个特殊的戊糖结构顺序，这个戊糖结构与抗凝血酶（AT-III)的结 合可以导致其构象改变而被活化。对肝素这个特殊五糖结构的微小改变都会导致与抗凝血 酶结合力的下降，从而显著降低其抗凝血活性。现有研究表明，肝素与AT-III结合发挥抗 凝血活性取决于其戊糖活性中心的数量。戊糖结构中N-位，3-0-位及6-0-位硫酸基参与结 合AT-III，与抗凝血活性有关；而2-0-位硫酸基和艾杜醛酸的作用尚不清楚，其中3-0-位 硫酸基尤其重要，如果缺少3-0-位硫酸基，肝素的抗凝血活性则会降低1000倍以上。另 有研究发现，N-位脱硫酸化肝素的抗凝、抗Flla、抗FXa活性分别是未修饰肝素的1.5%、 0. 9%、0. 1 %，说明N-位硫酸基是肝素抗凝活性所必需具有的。 国内外药物研究人员尝试用化学法对肝素的结构改造。化学法脱硫酸化可以在一 定的程度上降低肝素的副作用，但由于缺乏选择性，导致活性中心数量降低，抗凝血活性大 幅降低。化学法使肝素过硫酸化，理论上可能提高抗凝血活性中心的数量，从而提高其抗凝 血活性，但是由于硫酸化程度过高，导致其电荷密度过大，使其与血液蛋白非特异性相互作 用大幅增加，结果不仅未能增加其抗凝血活性，反而造成了更严重的毒副作用。通过选择性 酶反应则可增加抗凝血活性中心的数量，大幅度提高肝素的抗凝血活性，同时通过去硫酸 化酶，选择性去除与抗凝血活性无关的硫酸基，降低其电荷密度，可以大幅度降低其毒副作 用。 透明质酸是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖的双糖单位反复交替连接而成 的聚阴离子糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG)，除了润滑作用外，透明质酸在细胞增殖、 迁移，血管生成，细胞信号传导等过程中发挥重要作用。一些硫酸化的多糖具有类似肝素的 抗凝血作用，如硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素，且硫酸化程度越高，硫酸化多糖的抗凝血作用 越强，Balazs等较早利用化学法合成了硫酸化透明质酸，并证明了其抗凝血作用。 基于目前对肝素选择性结构改造的经验，利用透明质酸非硫酸化的特点，采用酶 法特异性的修饰与抗凝活性有关的位点，如3-0-位硫酸基；选择性地去掉一些与抗凝无关 的硫酸基，如6-0-位硫酸基，、2-0-位硫酸基，就有可能合成具有高抗凝活性的透明质酸衍 生物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。 本专利技术的技术方案为：以透明质酸为起始物，首先用化学法进行脱乙酰化透明质 酸的制备，然后在pH9. O的条件下用硫酸化试剂进行N-位硫酸化，在此基础上采用3' -磷 酸腺苷-5' -磷酰硫酸酯（PAPS)再生系统，以6-0-硫酸基转移酶出-OST)和3-0-硫酸基 转移酶（3-0ST)对抗凝血活性特定位点进行有效的选择性硫酸化，其次用6-0-脱硫酸基酶 (6-0-sulfatase)选择性去除与抗凝血活性无关的硫酸基，降低其电荷密度，合成得到具有 高抗凝活性的透明质酸衍生物。 本专利技术提出的具有高抗凝活性的透明质酸衍生物的具体操作步骤如下：采用化学 酶法来实现合成，首先从透明质酸出发，用化学法进行脱乙酰化透明质酸的制备，然后在PH 9. 0的条件下用硫酸化试剂进行N-位硫酸化，通过AST-IV和6-0ST-1合成N-位，6-0-位 硫酸化的衍生物，并进一步通过AST-IV和3-0ST-1合成N-乙酰氨基葡萄糖6位硫酸化的 衍生物，即得N-位，6-0-，3-0-位硫酸化透明质酸；最后再利用6-〇-sulfatase进行选择性 的6_0_位脱硫酸化，最终得到3_0_，N-位硫酸化透明质酸。 本专利技术的独到之处有两点：首先从透明质酸出发，用化学法和酶法组合最大限度 地提高抗凝血活性中心的数量，从而大幅度提高其抗凝血活性。其次用6-0-sulfatase酶 选择性脱去与抗凝血活性无关的硫酸基，降低其活性位点的电荷密度。这种透明质酸衍生 物抗凝活性高和毒副作用低，本专利技术将有助于拓宽透明质酸衍生物类药物的应用范围，因 此其不仅具有科学研究价值，而且将具有较大的社会价值和经济价值。 【具体实施方式】 以下利用实施例进一步详细说明本专利技术，但不能认为是限定专利技术的范围。 实施例一：N-脱乙酰化透明质酸的制备 将透明质酸溶解于2mol/L NaOH中，于60°C脱乙酰反应18h，反应结束后冷却至室 温，用2mol/L HCl调节pH至9. 0,防止脱乙酰化后由于氢键作用而沉淀，3500Da截留透析 袋透析，收集透析液冻干，即得脱乙酰化的透明质酸。 实施例二：N-位硫酸化透明质酸的制备 将N位脱乙酰化的透明质酸溶于去离子水，于40°C分四次加入硫酸化试剂三氧化 硫批陡（总投料比为N位脱乙酰化透明质酸：三氧化硫批陡=1:2)，每次补料间隔为Ih, 每次加完后用2mol/L NaOH调节pH至9. 5,再反应36h后，调节pH至中性，3500Da截留透 析袋透析，收集透析液冻干，即得N-位硫酸化透明质酸。 实施例三：N-位，6-0-位硫酸化透明质酸的制备 通常酶法硫酸化反应条件为Img N-位硫酸化透明质酸在20ml反应液中于室温下 震荡（300rpm)反应 6h。反应液包含 50mM Tris-HCl(pH 7.2)，1% Triton X-100，1%BSA， ImM MgCl2，lmM MnCl2，lmMPNPS，40yM PAP，8mg 6-0ST-1 及 4mg AST-IV。KKTC下加热反应 液十分钟终止反应，离心分离得到上清液，将此上清液与两倍体积的2. 0%的NaCl水溶液 混合，对DEAE柱上样；依次以2. 0%的NaCl水溶液和3. 0%的NaCl水溶液进行梯度洗脱， 收集第二次洗脱所得洗脱液。所得溶液用去离子水透析24小时，冻干得N-位，6-0-位硫酸 化透明质酸的冻干粉。 实施例四：N-位，6-0-，3-0_位硫酸化透明质酸的制备 酶法硫酸化反应条件为Img N-位，6-0-位硫酸化透明质酸在20ml反应液中于室 温下震荡（300rpm)反应 6h。反应液包含 50mM Tris-HCKpH 7.2)，1% Triton X-100，l% BSA，lmM MgCl2，lmM MnCl2，lmM PNPS，40yM PAP，8mg 3-0ST-1 及 4mg AST-IV。KKTC 下加 热反应液十分钟终止反应，离心分离得到上清液，将此上清液与两倍体积的2. O %的NaCl 水溶液混合，对DEAE柱上样；依次以2. O %的NaCl水溶液和3. O %的NaCl水溶液进行梯度 洗脱，收集第二次洗脱所得洗脱液。所得溶液用去离子水透析24小时，冻干得N-位，6-0-， 3-0-位硫酸化透明质酸的冻干粉。 实施例五：3-0_，N-位硫酸化透明质酸的制备 将上述透明质酸衍生物在20ml反应液中于室温下震荡（300rp本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有高抗凝活性的透明质酸衍生物的制备方法，以透明质酸为起始物，首先用化学法进行脱乙酰化透明质酸的制备，然后在pH 9.0的条件下用硫酸化试剂进行N‑位硫酸化，在此基础上采用3’‑磷酸腺苷‑5’‑磷酰硫酸酯(PAPS)再生系统，以6‑O‑硫酸基转移酶(6‑OST)和3‑O‑硫酸基转移酶(3‑OST)对抗凝血活性特定位点进行有效的选择性硫酸化，其次用6‑O‑脱硫酸基酶(6‑O‑sulfatase)选择性去除与抗凝血活性无关的硫酸基，降低其电荷密度，合成得到具有高抗凝活性的透明质酸衍生物。
【技术特征摘要】
1. 一种具有高抗凝活性的透明质酸衍生物的制备方法，以透明质酸为起始物，首先用 化学法进行脱乙酰化透明质酸的制备，然后在pH 9. 0的条件下用硫酸化试剂进行N-位硫 酸化，在此基础上采用3' -磷酸腺苷-5' -磷酰硫酸酯（PAPS)再生系统，以6-0-硫酸基转 移酶出-OST)和3-0-硫酸基转移酶（3-0ST)对抗凝血活性特定位点进行有效的选择性硫 酸化，其次用6-0-脱硫酸基酶（6-0-sulfatase)选择性去除与抗凝血活性无关的硫酸基， 降低其电荷密度，合成得到具有高抗凝活性的透明质酸衍生物。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将透明质酸溶解于2mol/L NaOH中，于 60°C脱乙酰反应18h，反应结束后冷却至室温，用2mol/L HC1调节pH至9. 0, 3500Da截留透 析袋透析，收集透析液冻干，将得到的脱乙酰化的透明质酸溶于去离子水，于40°C分四次加 入硫酸化试剂三氧化硫批陡（总投料比为N位脱乙酰化透明质酸：三氧化硫批陡=1:2)， 每次补料间隔为lh，每次加完后用2mol/L NaOH调节pH至9. 5,再反应36h后，调节pH至 中性，3500Da截留透析袋透析，收集透析液冻干。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：通过6-0ST-1和3-0ST-1将PAPS再生系 统中PAPS分子的活性硫酸基转移到透明质酸的特定序列位置，生成高抗凝血活性的透明 质酸衍生物；所述PAPS再生系统是通过AST-IV(Arylsulfotransferase IV)的酶促反应， 由对硝基苯酚磺酸钾盐（PNPS)和3' -磷酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：滕丽萍，付海田，王敏，陈敬华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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