一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，包括：温和还原法制备PEI包覆的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒；USPIO/PEI.NH2纳米颗粒表面修饰异硫氰酸荧光素(FI)和PEG化的RGD复合物(COOH-PEG-RGD)，以及纳米颗粒表面的乙酰化处理。本发明专利技术工艺简单，反应条件温和，易于操作；制备的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒粒径较小、弛豫率很高，并且具有良好的胶体稳定性、生物相容性和特定的αvβ3整合素高表达肿瘤细胞的靶向性，在体内肿瘤靶向MR成像诊断领域具有潜在的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法
本专利技术属于核磁共振成像造影剂的制备领域，特别涉及一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法。
技术介绍
近年来，超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒在生物医学领域有着越来越广泛的应用，特别是用作核磁共振成像(MRI)的造影剂。本课题组已通过简易的水热合成法制备了两种不同表面修饰的四氧化三铁纳米颗粒，并探索了其在MR成像诊断中应用的可行性(沈明武，蔡红东，史向阳。一种APTS修饰的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法。专利号：ZL201110104443.1；Caietal.，ACSAppl.Mater.Interfaces2013，5(5),1722–1731；37.史向阳，蔡红东，沈明武。一种HPEI包裹的氧化铁磁性纳米颗粒的制备方法。中国专利技术专利，申请号：201210277624.9，申请日期：2012-08-07)。这些制备的四氧化三铁纳米颗粒的弛豫率在80-160mM-1s-1之间，为了减少造影剂的剂量并达到灵敏检测的目的，制备具有更高弛豫率的四氧化三铁纳米颗粒就显得尤为有意义。在另一个研究工作中，通过温和还原法制备出超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒(USPIO)，其尺寸较小，并且表现出很高的弛豫率，在体内特定肿瘤的靶向MR成像诊断领域有着潜在的应用(沈明武，李静超，胡勇，孙文杰，史向阳。一种叶酸修饰的超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法。中国专利技术专利，申请号：2014101828211，申请日期：2014-04-30)。检索国内外文献，尚没有发现关于用还原法制备具有超高弛豫率的RGD特异靶向能力的USPIO纳米探针用于体外和体内脑胶质瘤模型的靶向MR成像诊断研究的相关报道。
技术实现思路
本专利技术提供一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作，成本较低；制备的USPIO磁性纳米颗粒能够长时间稳定地分散于水溶液中，不会出现团聚现象；所用的修饰剂PEI为廉价和环境友好材料，具有产业化实施的前景。本专利技术的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，包括：(1)将三价铁盐溶解于超纯水中，氮气鼓吹后加入亚硫酸钠溶液，反应30～40分钟；然后依次加入超支化聚乙烯亚胺PEI水溶液和NH3·H2O，60～70℃下恒温搅拌反应30～40分钟；然后在室温下反应1.5～3小时；反应结束后，将产物磁分离洗涤纯化，即得PEI包裹的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒USPIO/PEI.NH2；(2)将步骤(1)中制备的USPIO/PEI.NH2纳米颗粒用DMSO洗涤后，重新分散于DMSO中；再将DMSO溶解的FI加入到USPIO/PEI.NH2的DMSO溶液中，搅拌反应1～2天，磁分离洗涤并分散于水中，得到USPIO/PEI.NH2-FI纳米颗粒；(3)将6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯6-M与COOH-PEG-NH2混合于DMSO溶液中，搅拌反应10～12小时，得到COOH-PEG-6-M；然后再将充分溶解于DMSO中的端基为巯基的RGDSH-RGD逐滴加入到COOH-PEG-6-M的DMSO溶液中，搅拌反应1～2天，透析，真空冷冻干燥，即得到COOH-PEG-RGD；(4)将步骤(3)中制备的COOH-PEG-RGD与EDC、NHS混合溶解于DMSO后，搅拌活化2～4h；将步骤(2)中制备的USPIO/PEI.NH2-FI纳米颗粒用DMSO洗涤后，重新分散于DMSO中，然后加入活化的COOH-PEG-RGD溶液，搅拌反应2～4天，磁分离洗涤并分散于水中，得到USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-RGD纳米颗粒；(5)向步骤(4)中制备的USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-RGD纳米颗粒水溶液中加入三乙胺，并搅拌20～40分钟；然后加入乙酸酐，继续搅拌反应20～30小时，磁分离洗涤并分散于超纯水中，即得最终产物USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD。所述步骤(1)中的三价铁盐为FeCl3·6H2O；三价铁盐、超纯水、NH3·H2O的配比为1.2～1.4g:20～25mL:2～3mL，三价盐、亚硫酸钠、PEI的质量比为1.2～1.4:0.20～0.25:0.51～0.53。所述步骤(1)中的NH3·H2O质量百分比浓度为25～28％。所述步骤(1)中的超支化聚乙烯亚胺PEI的分子量为25000。所述步骤(2)中FI与USPIO/PEI.NH2表面氨基的摩尔比为1:39～40，优选1:40。所述步骤(3)中RGD、6-M和PEG的摩尔比为1:1.0～1.2:1.0～1.2，优选1:1.2:1。所述步骤(3)中NH2-PEG-COOH的分子量为2000。所述步骤(4)中的COOH-PEG-RGD与EDC、NHS的摩尔比为1:8～10:8～10，优选1:10:10。所述步骤(4)中的COOH-PEG-RGD与USPIO/PEI.NH2-FI纳米颗粒表面氨基的摩尔比为1:23～25，优选1:24。所述步骤(5)中的三乙胺、乙酸酐与USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-RGD纳米颗粒表面的PEI上的伯氨基摩尔比为8～10:10～12:1，优选10:12:1。本专利技术合成了一种基于RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒。为了克服裸露USPIO普遍存在的磁学特性导致的聚集现象，并提高其在生物医学成像领域的可应用性，在反应过程中加入聚乙烯亚胺(PEI)用于介导USPIO的合成，从而实现简易“一步”还原法制备了胶体稳定性良好的PEI包覆的USPIO(USPIO/PEI.NH2)。为了使制备的该种USPIO/PEI.NH2能有效地应用到生物体内，在其表面接上异硫氰酸荧光素(FI)用于纳米颗粒的示踪和荧光成像；为实现特定肿瘤部位的成像检测，在其表面修饰聚乙二醇-RGD复合物(Polyethyleneglycol-RGD,COOH-PEG-RGD)；最后通过乙酰化中和PEI表面剩余的氨基，降低纳米颗粒的表面电势，从而进一步提高其生物相容性。此外，实验数据表明，制备的USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD和对照材料USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米颗粒均有很显著的T2加权成像效果，其r2弛豫率分别高达550.04mM-1s-1和545.70mM-1s-1。最后以αvβ3整合素高表达的U87MG细胞(一种脑胶质瘤细胞)为模型细胞和移植瘤模型对制备的两种多功能纳米探针的性质进行一一评价。本专利技术制备的USPIO纳米探针在生物医学方面表现出良好特性，特别是超高的r2弛豫率，有望实现在不同疾病系统的准确和灵敏诊断，为USPIO纳米探针用作临床造影剂提供可靠的依据。本专利技术操作简便易行，原材料成本低。制备的纳米颗粒具有良好的分散性、胶体稳定性和生物相容性。与非靶向材料USPIO/PEI.NHAc-FI-mPEG纳米颗粒相比，RGD修饰的USPIO纳米颗粒使得肿瘤细胞或肿瘤部位信号更低，表明其具有更高的靶向性。从而说明该方法制备的RGD修饰的USPIO纳米颗粒在MR分子影像诊断领域有着潜在的应用。本专利技术使用X-射线衍射(XRD)、紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、热重分析(TGA)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，包括：(1)将三价铁盐溶解于超纯水中，氮气鼓吹后加入亚硫酸钠溶液，反应30～40分钟；然后依次加入超支化聚乙烯亚胺PEI水溶液和NH3·H2O，60～70℃下恒温搅拌反应30～40分钟；然后在室温下反应1.5～3小时；反应结束后，将产物磁分离洗涤纯化，即得PEI包裹的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒USPIO/PEI.NH2；(2)将步骤(1)中制备的USPIO/PEI.NH2纳米颗粒用DMSO洗涤后，重新分散于DMSO中；再将DMSO溶解的FI加入到USPIO/PEI.NH2的DMSO溶液中，搅拌反应1～2天，磁分离洗涤并分散于水中，得到USPIO/PEI.NH2‑FI纳米颗粒；(3)将6‑(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯6‑M与COOH‑PEG‑NH2混合于DMSO溶液中，搅拌反应10～12小时，得到COOH‑PEG‑6‑M；然后再将充分溶解于DMSO中的端基为巯基的RGD SH‑RGD逐滴加入到COOH‑PEG‑6‑M的DMSO溶液中，搅拌反应1～2天，透析，真空冷冻干燥，即得到COOH‑PEG‑RGD；(4)将步骤(3)中制备的COOH‑PEG‑RGD与EDC、NHS混合溶解于DMSO后，搅拌活化2～4h；将步骤(2)中制备的USPIO/PEI.NH2‑FI纳米颗粒用DMSO洗涤后，重新分散于DMSO中，然后加入活化的COOH‑PEG‑RGD溶液，搅拌反应2～4天，磁分离洗涤并分散于水中，得到USPIO/PEI.NH2‑FI‑PEG‑RGD纳米颗粒；(5)向步骤(4)中制备的USPIO/PEI.NH2‑FI‑PEG‑RGD纳米颗粒水溶液中加入三乙胺，并搅拌20～40分钟；然后加入乙酸酐，继续搅拌反应20～30小时，磁分离洗涤并分散于超纯水中，即得最终产物USPIO/PEI.NHAc‑FI‑PEG‑RGD。...

【技术特征摘要】
1.一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，包括：(1)将三价铁盐溶解于超纯水中，氮气鼓吹后加入亚硫酸钠溶液，反应30～40分钟；然后依次加入超支化聚乙烯亚胺PEI水溶液和NH3·H2O，60～70℃下恒温搅拌反应30～40分钟；然后在室温下反应1.5～3小时；反应结束后，将产物磁分离洗涤纯化，即得PEI包裹的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒USPIO/PEI.NH2；(2)将步骤(1)中制备的USPIO/PEI.NH2纳米颗粒用DMSO洗涤后，重新分散于DMSO中；再将DMSO溶解的FI加入到USPIO/PEI.NH2的DMSO溶液中，搅拌反应1～2天，磁分离洗涤并分散于水中，得到USPIO/PEI.NH2-FI纳米颗粒；(3)将6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯6-M与COOH-PEG-NH2混合于DMSO溶液中，搅拌反应10～12小时，得到COOH-PEG-6-M；然后再将充分溶解于DMSO中的端基为巯基的RGDSH-RGD逐滴加入到COOH-PEG-6-M的DMSO溶液中，搅拌反应1～2天，透析，真空冷冻干燥，即得到COOH-PEG-RGD；(4)将步骤(3)中制备的COOH-PEG-RGD与EDC、NHS混合溶解于DMSO后，搅拌活化2～4h；将步骤(2)中制备的USPIO/PEI.NH2-FI纳米颗粒用DMSO洗涤后，重新分散于DMSO中，然后加入活化的COOH-PEG-RGD溶液，搅拌反应2～4天，磁分离洗涤并分散于水中，得到USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-RGD纳米颗粒；(5)向步骤(4)中制备的USPIO/PEI.NH2-FI-PEG-RGD纳米颗粒水溶液中加入三乙胺，并搅拌20～40分钟；然后加入乙酸酐，继续搅拌反应20～30小时，磁分离洗涤并分散于超纯水中，即得最终产物USPIO/PEI.NHAc-FI-PEG-RGD。2.根据权利要求1所述的一种RGD修饰的超小型超顺磁氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈明武，胡勇，李静超，韦平，史向阳，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：上海;31