适配体磁富集和RCA双信号放大检测肿瘤细胞方法及应用技术

适配体磁富集和RCA双信号放大检测肿瘤细胞方法及应用。本发明专利技术公开了一种用于白血病细胞检测的探针组及其应用。本发明专利技术所提供的用于白血病细胞检测的探针组由如下a)和b)组成：a)磁珠捕获探针；所述磁珠捕获探针由磁珠和固定于所述磁珠上的捕获探针组成；所述捕获探针为序列1所示的单链DNA分子；b)检测探针或所述检测探针的前体；所述检测探针的前体由靶序列和磷酸标记的锁式探针组成；所述靶序列为序列2所示的单链DNA分子；所述磷酸标记的锁式探针的核苷酸序列为序列3所示的单链DNA分子；所述检测探针是由所述磷酸标记的锁式探针环化后与所述靶序列结合而成。实验证明，本发明专利技术实现了高特异性和高灵敏的检测，能从200万个正常人外周血细胞中检测出100个白血病细胞，灵敏度达到两万分之一。

【技术实现步骤摘要】
适配体磁富集和RCA双信号放大检测肿瘤细胞方法及应用
本专利技术属于生物材料的临床医学应用领域，涉及一种适配体磁富集和RCA双信号放大检测肿瘤细胞方法及应用，特别涉及一种用于检测白血病细胞的基于磁富集和RCA双信号放大的探针组及其应用。
技术介绍
白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他组织和器官，同时正常造血受抑制。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。白血病是我国的高发肿瘤之一，其分型诊断需要联合形态学、免疫表型、细胞遗传学和分子生物学等各种手段。由于细胞形态的多样性，单纯依靠形态学检查很难准确分型；也未发现白血病细胞特异性单克隆抗体，白血病作为一种高度异质性疾病，抗原表达有时较紊乱，跨系列表达较为常见，部分白血病相关抗原在治疗过程中或复发时会丢失或发生系列转换；利用细胞遗传学(染色体核型和显带)与分子生物学的检查方法，使诊断的客观性和准确率明显提高，但只有40％的急性淋巴细胞白血病(ALL)有染色体的异常，而且各种临床亚型并没有对应特异性染色体异常，另外、这些检查耗时、成本高，使之普及性有一定难度。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于白血病细胞检测的探针组。本专利技术所提供的用于白血病细胞检测的探针组，具体由如下(a)和(b)组成：(a)磁珠捕获探针；所述磁珠捕获探针由磁珠和固定于所述磁珠上的捕获探针(适配体)组成；所述捕获探针为序列表中序列1所示的单链DNA分子；(b)检测探针或所述检测探针的前体；所述检测探针的前体由靶序列和磷酸标记的锁式探针组成；所述靶序列为序列表中序列2所示的单链DNA分子；所述磷酸标记的锁式探针的核苷酸序列为序列表中序列3所示的单链DNA分子；所述检测探针是由环化的所述磷酸标记的锁式探针与所述靶序列结合而成。所述检测探针具体可按照包括如下步骤的方法由所述检测探针的前体制备得到的：将所述靶序列和所述磷酸标记的锁式探针按照摩尔比为1：(2-4)(如1：3)的比例混合，95℃孵育5-10min(如10min)后，加入DNA连接酶15-20℃(如16℃)孵育10-16h(如12h)，得到所述检测探针。更加具体的，在本专利技术的一个实施例中，所述检测探针的制备方法如下：(1)将所述靶序列和所述磷酸标记的锁式探针均用结合缓冲液(溶剂为水，溶质及浓度如下：NaCl8g/L，KCl0.2g/L，CaCl20.14g/L，Na2HPO4·H2O0.1g/L，MgCl2·6H2O1.42g/L，NaHCO30.35g/L，KH2PO40.2g/L，葡萄糖4.5g/L)配成5μM浓度，然后将所得靶序列溶液、磷酸标记的锁式探针溶液和无菌水按照体积比为1：3：6的比例混合，95℃加热10分钟，缓慢冷却至25℃；(2)向步骤(1)的体系中加入E.coliDNA连接酶，至其终浓度为0.04U/μl，16℃孵育12h。所述磁珠捕获探针具体可按照包括如下步骤的方法制备得到：将经生物素标记的所述捕获探针与经链霉亲和素标记的所述磁珠共同孵育，获得所述磁珠捕获探针。在本专利技术中，所述生物素具体标记于所述捕获探针的3’端。所述方法中，进行所述孵育时，经生物素标记的所述捕获探针与经链霉亲和素标记的所述磁珠的配比为75pmol：1mg。进一步，所述孵育具体为20-30℃(如25℃)80-150rpm(如100rpm)震荡孵育10-30(如15min)。所述孵育的液体环境为结合缓冲液；所述结合缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：NaCl8g/L，KCl0.2g/L，CaCl20.14g/L，Na2HPO4·H2O0.1g/L，MgCl2·6H2O1.42g/L，NaHCO30.35g/L，KH2PO40.2g/L，葡萄糖4.5g/L。更加具体的，在本专利技术的一个实施例中，所述磁珠捕获探针的制备方法包括如下步骤：分别取浓度为500nM(以DNA计量)的经生物素标记的所述捕获探针的溶液(溶剂为所述结合缓冲液)和浓度为10mg/ml(以磁珠计量)的经链霉亲和素标记的所述磁珠溶液(溶剂为所述结合缓冲液)，按照体积比3:2的配比混合，20-30℃(如25℃)80～150rpm(如100rpm)震荡孵育10-30min(如15min)，即获得所述磁珠捕获探针。含有所述探针组的试剂盒也属于本专利技术的保护范围。所述试剂盒中还含有分子信标；所述分子信标为由一端带有荧光基团，另一端带有淬灭基团，核苷酸序列为序列表中序列4所示单链DAN分子形成的颈环结构。在本专利技术中，所述分子信标的5’端标记有荧光基团FITC，3’端标记有淬灭基团DABCYL。所述探针组，或所述试剂盒，在如下任一中的应用也属于本专利技术的保护范围：(a)制备用于白血病细胞检测的试剂盒；(b)制备用于白血病病情监测的试剂盒。在本专利技术中，所述白血病细胞检测为从待测者的外周全血、骨髓细胞、白细胞或淋巴细胞中检测白血病细胞。在所述应用中，进行所述白血病病情监测时，采用的待测样本可为待测者的外周全血、骨髓细胞、白细胞或淋巴细胞。所述待测者可为白血病患者、健康的正常人、或患有其他疾病(如地中海贫血、骨髓异常增多症、或缺铁性贫血)的非白血病患者。在本专利技术中，所述白血病具体为急性淋巴细胞白血病(ALL)，如急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)。前文所述检测探针或所述检测探针的前体也属于本专利技术的保护范围。本专利技术采用磁富集和滚环扩增(rollingcircleamplification，RCA)双重信号放大方式形成了一种高特异性和高灵敏的肿瘤细胞检测方法。磁珠捕获探针能从大量对照细胞中将微量的靶细胞富集，并从中分离出来，相对于离心分离技术，操作简便，不易丢失细胞，有效减少了因细胞丢失而造成的信号降低；本专利技术还对反应时间等进行了优化，整个实验是在优化范围内最好的条件下进行的；为了提高适配体探针检测的灵敏性，本专利技术将检测探针检测信号经RCA信号放大。本专利技术还采用了分子信标做信号报告分子，该分子信标的环状部分能与RCA产物的重复序列完全互补。只有发生了RCA反应，RCA的长链产物有部分序列与分子信标杂交，使分子信标自身杂交打开，荧光信号才能得以恢复。分子信标的使用明显降低了背景荧光，提高了检测的灵敏度。另外，本专利技术在均相中进行，相比界面反应来说，细胞与适配体之间有更多的接触机会，保证了反应更加快速和完全。由于以上原因，本专利技术实现了高特异性和高灵敏的检测，能从200万个正常人外周血细胞中检测出100个白血病细胞，灵敏度达到两万分之一。附图说明图1为联合磁珠捕获探针和检测探针的RCA反应信号放大电泳检测结果及荧光仪检测结果。A为电泳成像结果；B为荧光仪检测结果。图2为荧光显微镜观察细胞上RCA扩增的情况。左侧图片为光学显微镜下观察，右侧为荧光显微镜下观察。A、B：为RCA反应后0分钟；C、D：为RCA反应后10分钟；E、F：为RCA反应后30分钟；G、H：为RCA反应后60分钟；I、J：为RCA反应后90分钟；K、L为RCA反应后120分钟。图3为流式细胞所检测细胞上RCA扩增的情况。A为流式细胞仪检测CEM细胞上RCA扩增效果；为流式细胞仪检测Ramos细胞上适配体RCA扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于白血病细胞检测的探针组，由如下(a)和(b)组成：(a)磁珠捕获探针；所述磁珠捕获探针由磁珠和固定于所述磁珠上的捕获探针组成；所述捕获探针为序列表中序列1所示的单链DNA分子；(b)检测探针或所述检测探针的前体；所述检测探针的前体由靶序列和磷酸标记的锁式探针组成；所述靶序列为序列表中序列2所示的单链DNA分子；所述磷酸标记的锁式探针的核苷酸序列为序列表中序列3所示的单链DNA分子；所述检测探针是由环化的所述磷酸标记的锁式探针与所述靶序列结合而成。

【技术特征摘要】
1.一种用于白血病细胞检测的探针组，由如下(a)和(b)组成：(a)磁珠捕获探针；所述磁珠捕获探针由磁珠和固定于所述磁珠上的捕获探针组成；所述捕获探针为序列表中序列1所示的单链DNA分子；(b)检测探针或所述检测探针的前体；所述检测探针的前体由靶序列和磷酸标记的锁式探针组成；所述靶序列为序列表中序列2所示的单链DNA分子；所述磷酸标记的锁式探针的核苷酸序列为序列表中序列3所示的单链DNA分子；所述检测探针是由环化的所述磷酸标记的锁式探针与所述靶序列结合而成。2.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于：所述检测探针是按照包括如下步骤的方法由所述检测探针的前体制备得到的：将所述靶序列和所述磷酸标记的锁式探针按照摩尔比为1：(2-4)的比例混合，95℃孵育5-10min后，加入DNA连接酶15-20℃孵育10-16h，得到所述检测探针。3.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于：所述磁珠捕获探针按照包括如下步骤的方法制备得到：将经生物素标记的所述捕获探针与经链霉亲和素标记的所述磁珠共同孵育，获得所述磁珠捕获探针。4.根据权利要求3所述的探针组，其特征在于：进行所述孵育时，经生物素标记的所述捕获探针与经链霉亲和素标记的所述磁...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵永祥，李霞，卢小玲，黄勇，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西;45