一种转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法，转基因大豆及其衍生品种为转基因大豆GTS40-3-2、Mon89788、A5547-127及其衍生品种，其Arm-PCR检测引物组包括内参Lectin引物组、特异性的套式PCR引物、超级上游引物Fs和超级下游引物Rs，特异性的套式PCR引物用于Arm-PCR的第一步扩增，超级上游引物Fs和超级下游引物Rs用于Arm-PCR的第二步扩增，检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照，采用六对套式引物和一对超级引物，在DNA聚合酶的作用下，对DNA模板进行扩增，用毛细管电泳检测扩增结果。本发明专利技术具有低成本、快速、高通量和阳性检出率高等优势，并具有兼容性、特异性、敏感性、半定量性、灵活性、重复性和高效性。

【技术实现步骤摘要】

 本专利技术涉及生物学
，具体是一种转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法。
技术介绍
20世纪80年代，除草剂生产公司从矮牵牛中克隆获得抗性基因—EPSPS基因，即农杆菌的5-烯酮丙酮酸莽草酸-3-磷酸酶基因。应用Ti质粒介导转移DNA技术，将矮牵牛Ti质粒中35S启动子控制的EPSPS基因导入大豆基因组中，进而育成抗除草剂草甘膦的转基因大豆品种，简称RR大豆。这种转基因大豆于1994年获得美国FDA批准，并较早地成为进行商业化大规模推广生产的转基因作物之一。RR大豆对非选择性除草剂——农达有高度耐性，即使在大田中施用草甘膦除草剂，也不影响大豆产量，适于大面积机械种植。据农业生物技术应用国际服务机构资料显示，2001年世界种植大豆总面积7200万公顷，而转基因大豆有3330万公顷占据全球转基因作物的63%，且均为抗除草剂大豆。当然除此之外，还有一些改良性状的新品种大豆也相继问世，如杜邦公司培育出的油酸含量达70%以上的大豆；此外，在美国低亚麻酸大豆、低棕桐酸大豆、高硬脂酸大豆、高棕搁酸大豆等转基因品种也已培育成功。利用基因工程方法所培养出的高油酸含量，同时降低了多不饱和脂肪酸含量，而且不存在反式脂肪酸，因此是一种理想的植物油。营养学家则称21世纪是“大豆世纪”。由此可见，转基因大豆在转基因作物及未来食品中占有重要地位。为了能够对转基因作物及其产品做出综合评价，除了需要各国政府和国际机构制定科学的安全评价体系以及严格的管理法规外，建立有效的方法体系对转基因作物进行检测也很重要，这是对转基因作物进行安全性评价和实施监管的基础，也是农产品国际贸易健康发展的重要保障。转基因产品的检测要求方法要快速，准确，灵敏，并且还得考虑适应大样品量，目标基因种类多等特点。目前国际上转基因作物及其产品的检测方法主要分为两种：酶联免疫法和聚合酶链式反应法，而基于分子生物学原理的PCR技术是近年来检测转基因生物体的常用方法，包括定性PCR方法、符合PCR方法、巢式PCR方法、竞争性定量PCR方法和荧光定量PCR方法等。但是上述的PCR方法往往检测效率低、耗费时间长，而常规的多重PCR技术涉及多个靶标和引物对，随着反应体系内引物数量的增加，错误引发扩增和引物相互干扰的几率大大增加，从而导致靶点扩增不兼容、扩增背景过高、可重复性差等问题，限制了该技术在多靶标的同步检测中的实际应用范围。扩增子拯救多重PCR技术，以下简称Arm-PCR技术，其原理是针对多重PCR体系中的每个靶序列，分别设计两对套式引物，使其可以形成4种扩增引物组合；由于每个靶序列都有4种可能的扩增模式。从而使得寻找不同靶序列最佳通用的扩增条件变得简单可行，最终实现对多种靶基因的高特异性、高灵敏度的同步扩增。目前尚未有将Arm-PCR法应用于快速检测转基因大豆及其衍生品种的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种兼容性高、敏感性强的转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法，所述转基因大豆及其衍生品种为转基因大豆GTS40-3-2、Mon89788、A5547-127及其衍生品种，所述转基因大豆GTS40-3-2、Mon89788、A5547-127及其衍生品种的Arm-PCR检测引物组包括内参Lectin引物组、特异性的套式PCR引物、超级上游引物Fs和超级下游引物Rs，所述特异性的套式PCR引物包括正向外引物Fo、反向外引物Ro、正向内引物Fi、反向内引物Ri，所述特异性的套式PCR引物用于Arm-PCR的第一步扩增，所述超级上游引物Fs和超级下游引物Rs用于Arm-PCR的第二步扩增；所述内参Lectin引物组、特异性的套式PCR引物、超级上游引物Fs和超级下游引物Rs的核苷酸序列分别如下所示：GTS40-3-2正向外引物Fo：CTTCCCGTTACCTTGCGCGG；GTS40-3-2反向外引物Ro：CGGTGAGCTTGCCGCGGCCT；GTS40-3-2正向内引物Fi：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGTCCGCCGTGCTGCTCGCCG；GTS40-3-2反向内引物Ri：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTCAGGCGGATGGTGCGCACGC；Mon89788正向外引物Fo：GAGACTGATGCTGACGGTGT；Mon89788反向外引物Ro：CACTTCGATGTCGGCACCCA；Mon89788正向内引物Fi：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTGCTTTCCCATTGGTTGCT；Mon89788反向内引物Ri：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTATGAGACCAGTACGGGTTGG；A5547-127正向外引物Fo：GGACAGGGTACCCGGGGATC；A5547-127反向外引物Ro：TAGCCTTCCAGGGCCCAGCG；A5547-127正向内引物Fi：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGCTGATATGGCCGCGGTTTG；A5547-127反向内引物Ri：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTGTGGTGTTTGTGGCTCTGTC；Lectin正向外引物Fo：CCAAGTCATCGACGTGCCGG；Lectin反向外引物Ro：GCCACGTCTTCGCCGCCGGC；Lectin正向内引物Fi：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGCCTTCCCGCTGGTTGCGGC；Lectin反向内引物Ri：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTGATGACTTCGATGTCGGCGC；超级上游引物Fs：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTAC；超级下游引物Rs：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGT。作为本专利技术进一步的方案：所述Arm-PCR检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照物，所述引物液包含特异性的套式PCR引物、超级上游引物Fs和超级下游引物Rs，其中正向外引物Fo的浓度为1-3μM，反向外引物Ro的浓度为1-3μM，正向内引物Fi的浓度为1-3μM，反向内引物Ri的浓度为1-3μM，超级上游引物Fs的浓度为8-12μM，超级下游引物Rs的浓度为8-12μM；所述反应液中包含Arm-PCR反应缓冲液、浓度为6mM的MgCl2和浓度为10mM的dNTP；所述DNA聚合酶的浓度为7-9U/μl；所述对照物中阳性对照为大豆标准内参Lectin引物组，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。作为本专利技术进一步的方案：所述引物液中正向外引物Fo的浓度为2μM，反向外引物Ro的浓度为2μM，正向内引物Fi的浓度为2μM，反向内引物Ri的浓度为2μM，超级上游引物Fs的浓度为10μM，超级下游本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转基因大豆及其衍生品种的Arm‑PCR检测方法，其特征在于，所述转基因大豆及其衍生品种为转基因大豆GTS40‑3‑2、Mon89788、A5547‑127及其衍生品种，所述转基因大豆GTS40‑3‑2、Mon89788、A5547‑127及其衍生品种的Arm‑PCR检测引物组包括内参Lectin引物组、特异性的套式PCR引物、超级上游引物Fs和超级下游引物Rs，所述特异性的套式PCR引物包括正向外引物Fo、反向外引物Ro、正向内引物Fi、反向内引物Ri，所述特异性的套式PCR引物用于Arm‑PCR的第一步扩增，所述超级上游引物Fs和超级下游引物Rs用于Arm‑PCR的第二步扩增；所述内参Lectin引物组、特异性的套式PCR引物、超级上游引物Fs和超级下游引物Rs的核苷酸序列分别如下所示：GTS40‑3‑2正向外引物Fo：CTTCCCGTTACCTTGCGCGG；GTS40‑3‑2反向外引物Ro：CGGTGAGCTTGCCGCGGCCT；GTS40‑3‑2正向内引物Fi：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGTCCGCCGTGCTGCTCGCCG；GTS40‑3‑2反向内引物Ri：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTCAGGCGGATGGTGCGCACGC；Mon89788正向外引物Fo：GAGACTGATGCTGACGGTGT；Mon89788反向外引物Ro：CACTTCGATGTCGGCACCCA；Mon89788正向内引物Fi：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTGCTTTCCCATTGGTTGCT；Mon89788反向内引物Ri：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTATGAGACCAGTACGGGTTGG；A5547‑127正向外引物Fo：GGACAGGGTACCCGGGGATC；A5547‑127反向外引物Ro：TAGCCTTCCAGGGCCCAGCG；A5547‑127正向内引物Fi：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGCTGATATGGCCGCGGTTTG；A5547‑127反向内引物Ri：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTGTGGTGTTTGTGGCTCTGTC；Lectin正向外引物Fo：CCAAGTCATCGACGTGCCGG；Lectin反向外引物Ro：GCCACGTCTTCGCCGCCGGC；Lectin正向内引物Fi：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGCCTTCCCGCTGGTTGCGGC；Lectin反向内引物Ri：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTGATGACTTCGATGTCGGCGC；超级上游引物Fs：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTAC；超级下游引物Rs：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGT。...

【技术特征摘要】
1.一种转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法，其特征在于，所述转基因大豆及其衍生品种为转基因大豆GTS40-3-2、Mon89788、A5547-127及其衍生品种，所述转基因大豆GTS40-3-2、Mon89788、A5547-127及其衍生品种的Arm-PCR检测引物组包括内参Lectin引物组、特异性的套式PCR引物、超级上游引物Fs和超级下游引物Rs，所述特异性的套式PCR引物包括正向外引物Fo、反向外引物Ro、正向内引物Fi、反向内引物Ri，所述特异性的套式PCR引物用于Arm-PCR的第一步扩增，所述超级上游引物Fs和超级下游引物Rs用于Arm-PCR的第二步扩增；所述内参Lectin引物组、特异性的套式PCR引物、超级上游引物Fs和超级下游引物Rs的核苷酸序列分别如下所示：
GTS40-3-2正向外引物Fo：CTTCCCGTTACCTTGCGCGG；
GTS40-3-2反向外引物Ro：CGGTGAGCTTGCCGCGGCCT；
GTS40-3-2正向内引物Fi：
GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGTCCGCCGTGCTGCTCGCCG；
GTS40-3-2反向内引物Ri：
CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTCAGGCGGATGGTGCGCACGC；
Mon89788正向外引物Fo：GAGACTGATGCTGACGGTGT；
Mon89788反向外引物Ro：CACTTCGATGTCGGCACCCA；
Mon89788正向内引物Fi：
GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTGCTTTCCCATTGGTTGCT；
Mon89788反向内引物Ri：
CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTATGAGACCAGTACGGGTTGG；
A5547-127正向外引物Fo：GGACAGGGTACCCGGGGATC；
A5547-127反向外引物Ro：TAGCCTTCCAGGGCCCAGCG；
A5547-127正向内引物Fi：
GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGCTGATATGGCCGCGGTTTG；
A5547-127反向内引物Ri：
CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTGTGGTGTTTGTGGCTCTGTC；
Lectin正向外引物Fo：CCAAGTCATCGACGTGCCGG；
Lectin反向外引物Ro：GCCACGTCTTCGCCGCCGGC；
Lectin正向内引物Fi：
GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACGCCTTCCCGCTGGTTGCGGC；
Lectin反向内引物Ri：
CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTGATGACTTCGATGTCGGCGC；
超级上游引物Fs：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTAC；
超级下游引物Rs：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGT。
2.根据权利要求1所述的转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法，其特征在于，所述Arm-PCR检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照物，所述引物液包含特异性的套式PCR引物、超级上游引物Fs和超级下游引物Rs，其中正向外引物Fo的浓度为1-3μM，反向外引物Ro的浓度为1-3μM，正向内引物Fi的浓度为1-3μM，反向内引物Ri的浓度为1-3μM，超级上游引物Fs的浓度为8-12μM，超级下游引物Rs的浓度为8-12μM；所述反应液中包含Arm-PCR反应缓冲液、浓度为6m...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽娟，方雪恩，陈旭，徐凌佳，孔继烈，
申请(专利权)人：上海速芯生物科技有限公司，复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31