基于数字PCR鉴定纯合型或杂合型NK603的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于数字PCR鉴定纯合型或杂合型NK603的方法，涉及分子生物学及转基因检测技术领域。本方法是：①收集：采用欧盟经过验证的NK603特异性转化事件以及玉米内标准基因adh1定量检测方法；②数字PCR扩增：以NK603的DNA为研究模板；③数据分析：如果NK603特异性转化事件和玉米内标准基因adh1目标分子数计算值的95%置信区间有重叠，判定为纯合型NK603；如果NK603特异性转化事件目标分子数计算值的95%置信区间的二倍和玉米内标准基因adh1目标分子数计算值的95%置信区间有重叠，则判定为杂合型NK603；本发明专利技术是一种快速、准确、可靠的鉴定纯合型和杂合型转基因耐除草剂玉米品系NK603绝对定量的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学及转基因检测
，尤其涉及一种基于数字PCR鉴定纯合型或杂合型NK603的方法。
技术介绍
近年来，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等转基因作物已在很多国家获准种植和生产，截止到2013年，世界范围内已经有27种作物涉及336个转化体在36个不同的国家和地区获准种植或用作加工原料，种植面积已达1.75亿公顷，其中27%的面积种植着包括多个转化事件的基因叠加品种（James，2013，国际农业生物技术应用服务组织）。随着转基因事件的不断增加，给各国转基因生物安全监管带来的越来越大的挑战。转基因产品检测标准物质是转基因生物及其产品成分检测的重要物质基础，在制备转基因标准物质的程序和环节过程中，原材料纯合度鉴定是制备标准物质的关键环节，目前美国油脂化学家协会（AOCS）和欧盟标准物质和度量研究所（IRMM）鉴定纯合度的方法主要是采用传统的育种方式或实时荧光定量PCR 的方法（李允静等，2013，中国农业科学）。同时，研究发现采用传统育种方式，需要通过多年多代自交，才能获得纯合转基因材料，耗时长，费时费力；而实时荧光定量PCR方法本身误差大，对转基因作物进行纯合度鉴定时，误差比较大，给结果判定带来很大困难。数字PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)作为DNA定量的新技术，实现了单分子DNA 绝对定量。目前在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测和下一代测序等方面的研究发挥了重要作用（李亮等，2012，生物化学与生物物理进展）。Corbisier 等采用数字PCR技术分析了转基因抗虫玉米MON810种子粉末的外源检测基因和hmgA基因的拷贝数，发现采用数字PCR检测的拷贝数比值绝对定量结果，同采用实时荧光定量PCR的方法并利用质粒DNA 做标准物质对种子粉末进行相对定量的结果比值相一致。因此提出了数字PCR具有计量特性，可以用来测量转基因相关标准物质的DNA拷贝数比率．单分子扩增效率对于改善总DNA 片段的拷贝数和短片段完整DNA 的估计偏差有显著意义。目标DNA 分子在反应室的随机和独立分布是数字PCR准确定量的关键，Bhat 等认为，反应室的容量是不确定度的主要来源，并且评定的相对不确定度在6%以下，这项发现可以用于其他数字PCR 测量的置信水平研究。我们希望通过利用数字PCR技术，建立一种鉴定纯合型或杂合型转基因耐除草剂玉米品系NK603的方法，进而为制备标准物质或原材料的鉴定繁殖工作奠定基础，保障材料背景的真实可靠。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服现有采用传统育种和应用实时荧光定量PCR方法鉴定转基因材料纯合度存在的困难，提供一种基于数字PCR鉴定纯合型或杂合型NK603的方法，所述的NK603是转基因耐除草剂玉米品种。本专利技术的目的是这样实现的：一、基于数字PCR鉴定纯合型或杂合型NK603的方法①收集采用欧盟经过验证的NK603特异性转化事件以及玉米内标准基因adh1定量检测方法，NK603引物序列：NK603F：5’-ATGAATGACCTCGAGTAAGCTTGTTAA-3’，NK603R：5’-AAGAGATAACAGGATCCACTCAAACACT-3’；NK603探针序列： 5’-FAM-TGGTACCACGCGACACACTTCCACTC-TAMRA-3’；内标准基因adh1引物序列：adh1F：5’-CCAGCCTCATGGCCAAAG-3’，adh1R：5’-CCTTCTTGGCGGCTTATCTG-3’；内标准基因adh1探针序列：adh1P：5’-FAM-CTTAGGGGCAGACTCCCGTGTTCCCT-TAMRA-3’；②数字PCR扩增以NK603 的DNA为研究模板，分别利用上述引物探针组合进行数字PCR扩增，将NK603用水稀释至5ng/μl或8ng/μl的浓度，在48.770的数字芯片上分别对两个参数进行数字PCR扩增，并收集目标分子荧光信号；③数据分析利用数字PCR仪数据分析软件对检测数据进行统计，分别计算NK603特异性转化事件和玉米内标准基因adh1目标分子数计算值的95%置信区间；如果NK603品系中特异性转化事件和玉米内标准基因adh1目标分子数计算值的95%置信区间有重叠，判定为纯合型NK603；如果NK603品系中特异性转化事件目标分子数计算值的95%置信区间的二倍和玉米内标准基因adh1目标分子数计算值的95%置信区间有重叠，则判定为杂合型NK603。工作机理：本方法利用数字PCR技术对单分子DNA进行绝对定量的基本工作原理，采用当前分析化学热门研究领域的微流控方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。对转基因作物的外源基因和内标准基因分别进行独立的扩增，根据采集到的目标荧光分子数，分别计算统计外源基因和内标基因目标分子数，以及特异性转化事件和内标准基因目标分子数计算值的95%置信区间是否有重叠，来鉴定转基因作物的纯合度。二、应用当模板量为6ng和9.6ng时，本方法能够成功鉴定出纯合型或杂合型转基因耐除草剂玉米品系NK603。与现有技术方法相比，本专利技术具有下列优点和积极效果：①首次提供了利用数字PCR技术来鉴定转基因耐除草剂玉米品系NK603纯合度的方法；②避免了利用传统育种方法筛选纯合型或杂合型转基因耐除草剂玉米品系NK603耗时长的问题；③避免了利用实时荧光定量PCR方法鉴定纯合型或杂合型转基因耐除草剂玉米品系NK603误差大、结果判断困难的问题。 总之，本专利技术是一种快速、准确、可靠的鉴定纯合型和杂合型转基因耐除草剂玉米品系NK603绝对定量的方法。附图说明图1是模板量为6ng的纯合型NK603，玉米内标准基因adh1在微流体面板上的扩增曲线，重复1；图2是模板量为6ng的纯合型NK603，玉米内标准基因adh1在微流体面板上的扩增曲线，重复2；图3是模板量为6ng的纯合型NK603，玉米内标准基因adh1在微流体面板上的扩增曲线，重复3；图4是模板量为6ng的纯合型NK603，玉米内标准基因adh1在微流体面板上的扩增曲线，重复4；图5是模板量为6ng的纯合型NK603，玉米内标准基因adh1在微流体面板上的扩增曲线，重复5；图6是模板量为6ng的纯合型NK603，玉米内标准基因adh1在微流体面板上的扩增曲线，重复6；图7是模板量为6ng的纯合型NK603，NK603特异性转化事件在微流体面板上的扩增曲线，重复1；图8是模板量为6ng的纯合型NK603，NK603特异性转化事件在微流体面本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于数字PCR鉴定纯合型或杂合型NK603的方法，其特征在于：①收集采用欧盟经过验证的NK603特异性转化事件以及玉米内标准基因adh1定量检测方法，NK603引物序列：NK603F：5’‑ATGAATGACCTCGAGTAAGCTTGTTAA‑3’，NK603R：5’‑AAGAGATAACAGGATCCACTCAAACACT‑3’；NK603探针序列： 5’‑FAM‑TGGTACCACGCGACACACTTCCACTC‑TAMRA‑3’；内标准基因adh1引物序列：adh1F：5’‑CCAGCCTCATGGCCAAAG‑3’，adh1R：5’‑CCTTCTTGGCGGCTTATCTG‑3’；内标准基因adh1探针序列：adh1P：5’‑FAM‑CTTAGGGGCAGACTCCCGTGTTCCCT‑TAMRA‑3’；②数字PCR扩增以NK603 的DNA为研究模板，分别利用上述引物探针组合进行数字PCR扩增，将NK603用水稀释至5ng/μl或8ng/μl的浓度，在48.770的数字芯片上分别对两个参数进行数字PCR扩增，并收集目标分子荧光信号；③数据分析利用数字PCR仪数据分析软件对检测数据进行统计，分别计算NK603特异性转化事件和玉米内标准基因adh1目标分子数计算值的95%置信区间；如果NK603品系中特异性转化事件和玉米内标准基因adh1目标分子数计算值的95%置信区间有重叠，判定为纯合型NK603；如果NK603品系中特异性转化事件目标分子数计算值的95%置信区间的二倍和玉米内标准基因adh1目标分子数计算值的95%置信区间有重叠，则判定为杂合型NK603；所述的NK603是转基因耐除草剂玉米品种。...

【技术特征摘要】
1.一种基于数字PCR鉴定纯合型或杂合型NK603的方法，其特征在于：
①收集
采用欧盟经过验证的NK603特异性转化事件以及玉米内标准基因adh1定量检测方法，
NK603引物序列：
NK603F：5’-ATGAATGACCTCGAGTAAGCTTGTTAA-3’，
NK603R：5’-AAGAGATAACAGGATCCACTCAAACACT-3’；
NK603探针序列： 
5’-FAM-TGGTACCACGCGACACACTTCCACTC-TAMRA-3’；
内标准基因adh1引物序列：
adh1F：5’-CCAGCCTCATGGCCAAAG-3’，
adh1R：5’-CCTTCTTGGCGGCTTATCTG-3’；
内标准基因adh1探针序列：
adh1P：5’-FAM-CTTAGGGGCAGACTCCCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：李允静，吴刚，李晓飞，武玉花，李飞武，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42