一种基于mmLDL上调脑基底动脉的ETB受体的方法。将大鼠脑基底动脉与mmLDL共培养24小时，考察信号转导通路时，加入相应的信号转导通路抑制剂。使用肌张力描记仪测定微血管张力，使用real-time PCR和Western blot分别检测mRNA水平和蛋白水平。结果，新鲜脑基底动脉环ETB受体基本不介导收缩，器官培养显著增加ETB受体介导的收缩，收缩量效曲线左移，同时Emax达到88±6％，与10μg/ml mmLDL共培养，引起收缩量效曲线进一步左移，Emax达到116±12％。mmLDL可以通过激活PKC，MAPK和NF-кB信号转导通路上调脑基底动脉ETB受体。
【技术实现步骤摘要】
-种基于mmLDL上调脑基底动脉的ETB受体的方法
本专利技术涉及生物化学领域，特别涉及一种基于mmLDL上调脑基底动脉的ETB受体 的方法。
技术介绍
弱氧化低密度脂蛋白（Minimally modified low density lipoprotein，mmLDL)是 脑血管疾病的危险因子。氧化型低密度脂蛋白（Fully oxidized LDL，oxLDL)是mmLDL进 一步氧化的产物。mmLDL和oxLDL诱导细胞分裂和增殖，导致细胞死亡，促进炎症分子和生 长因子的表达。mmLDL可以和细胞膜上的LDL受体结合。有研究显示mmLDL发挥生物效应 与激活受体介导的信号转导途径有关。 脑血管内皮分泌内皮素 (endothelin-1，ET-1)通过激活内皮素 A(endothelin type A，ETa)受体和内皮素 B(endothelin type B，ETb)受体介导脑血管收缩和增殖。内皮 细胞上ETb受体介导舒张功能。ET b受体可塑性强，在试验性脑缺血动物模型，动脉粥样硬 化病变部位，充血性心衰动物模型，蛛网膜下腔出血动物模型，在器官培养血管发现激活转 录，使血管平滑肌上出现了介导血管收缩的ET b受体。 蛋白激酶C (protein kinase C，PKC)家族是包含丝氨酸/苏氨酸的激酶，参与激 素、神经递质及生长因子刺激诱发的信号转导。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族是另一类含有丝氨酸/苏氨酸的激酶的家族，在平滑肌 细胞信号瀑布级联传导时，位于PKC的下游。MAPK分为3型，ERK1/2 (extracellular signal related kinases I and 2, ERK1/2)型，JNK(C_jun terminal kinase, JNK)型， 及p38 MAPK。MPK将细胞外信号传达入细胞内，是细胞内信号转导途径。核转录因 子-K B(Transcription factor nuclear factor_kappaB，NF-K：B)是下游的转录因子参与 炎症介质的调节和表达。 对脑血管环的器官培养是一种体外模型，实验证明器官培养能很好模拟脑血管疾 病时G-蛋白偶联受体的变化，并且器官培养方法利于进一步研究受体改变的分子机制。现 有技术中对于mmLDL对脑基底动脉ET b受体的影响机制尚不清晰，因此，急需一种实验方 法，来研究mmLDL是否改变ETb受体介导的收缩功能及受体表达，同时观察涉及的细胞内信 号转导分子机制。
技术实现思路
为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种基于mmLDL上调脑 基底动脉的ETB受体的方法。 为达到上述目的，本专利技术的技术方案为： -种基于mmLDL上调脑基底动脉的ETB受体的方法。其具体步骤为： 步骤一、动脉环的制备及器官培养 SD大鼠用CO2麻醉，断头处死，迅速取出大脑放入冷的碳酸氢盐缓冲液，取出脑基 底动脉，显微镜下剥离血管周围组织，血管内插入一根细线机械旋转去除内皮，将处理好的 血管切成Imm长的圆环，当乙酰胆碱引起的舒张率< 10%，认为内皮已被去除， 血管环在24孔板进行器官培养，每孔2个血管环，每孔加入含100 μ g/ml链霉素、 lOOU/ml青霉素的培养液培养24h，在37°C，含5% CO2和95% O2的培养箱内培养，由于器官 培养本身可以在脑基底动脉诱发ETb受体上调，在考察mmLDL对ETb受体的作用时将器官培 养组设为一个对照组，LDL组为另一个对照组，预实验脑基底动脉环分别与5,10和20 μ g/ mL的mmLDL共培养，培养时间分别为6,12, 24和48h，预实验显示1 μ L的DMSO加入ImL的 DMEM不影响实验结果，为了考察mmLDL对ETb受体的作应机制，使用了信号转导通路的特异 性拮抗剂， PKC 通路拮抗剂选用 0· lyMstaurosporine，ERK1/2 通路拮抗剂为 10yMU0126 和 10 μ MSB386023, U0126 拮抗 MAP 激酶 /ERK 激酶 1/2,即拮抗 MAPKK ;SB386023 拮抗上游 的MAPKKK，特异性的JNK通路拮抗剂为10 μ MSP600125, p38 MPK通路拮抗剂为10 μ M的 SB203580，NF-κ B通路诘抗剂为10 μ M的wedelolactone，每一个诘抗剂均与mmLDL同时 加入并共培养24h，然后，血管环置入浴槽做血管环张力实验，如果做RT-PCR或者western blot实验，血管环放入液氮冷冻3小时然后存储于-80°C冰箱； 步骤二、动脉环肌张力实验 将脑基底动脉环套在两个L型的金属针上，其中一个连接张力换能器，另一个连 微调装置，通过软件Chart5. 0以及硬件PowerLab 8通道桥式放大器，将血管所负荷张力 显示于屏幕，将安装好的动脉环置入含有5ml Krebs液的37°C Myograph恒温浴槽，持续通 入含95 % O2和5 % CO2的混合气体，pH保持7. 4,实验前，脑基底动脉环静息负荷I. 5mN，每 20min换液一次，稳定lh，以含K+63. 5mM的K+-Krebs液检验动脉环收缩性，两次收缩高度大 于ImN且收缩幅度相差< 10%者用于实验， 在浴槽中浓度累加法加入KTkiM-KT7M的S6c，选择性激动ET b受体，可以得到ETb 受体介导的量效曲线； 步骤三、实时定量PCR 总的RNA提取使用RNAfast200试剂盒，按照使用说明书提取，提取的RNA逆转录 成cDNA使用GeneAmp RNA PCR试剂盒，按照说明书在Perkin-Elmer公司的DNA热循环仪 完成，RT-PCR在GeneAmp5700扩增仪中进行，使用基因扩增的SYBR Green试剂盒，以cDNA 为模版，设立对照组，除不加 cDNA外，余平行操作， 受体的特异性引物根据基因数据库应用引物表达-2软件设计，大鼠 ETb受体特异 性引物，基因库编号NM_〇17333,设计如下： 前引物：5' -TGACGCCACCCACTAAGACC-3' 后引物：5，-GGCACGGAGGAGGGAAGG-3， Beta-actin mRNA为官家基因，引物设计如下： 前引物：5，-ACTATCGGCAATGAGCGGTTCC-3， 后引物：5' -CTGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG-S' 步骤四、Western blotting 实验时取出存于_80°C冰箱的脑基底动脉，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞提取变 性缓冲液RIPA裂解液，匀浆，使用BCA蛋白分析试剂盒蛋白定量，使用SDS-PAGE凝胶分离， 电转膜仪转膜至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭，一抗为I : 100稀释的兔抗大鼠 ETb受体抗体， 和1 : 500稀释的小鼠抗大鼠 β-actin抗体，稀释液为含2%牛血清白蛋白的PBS ;二抗为 辣根过氧化物酶标记的1 : 2000稀本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于mmLDL上调脑基底动脉的ETB受体的方法，其特征在于，具体步骤为：步骤一、动脉环的制备及器官培养SD大鼠用CO2麻醉，断头处死，迅速取出大脑放入冷的碳酸氢盐缓冲液，取出脑基底动脉，显微镜下剥离血管周围组织，血管内插入一根细线机械旋转去除内皮，将处理好的血管切成1mm长的圆环，当乙酰胆碱引起的舒张率＜10％，认为内皮已被去除，血管环在24孔板进行器官培养，每孔2个血管环，每孔加入含100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素的培养液培养24h，在37℃，含5％CO2和95％O2的培养箱内培养，由于器官培养本身可以在脑基底动脉诱发ETB受体上调，在考察mmLDL对ETB受体的作用时将器官培养组设为一个对照组，LDL组为另一个对照组，预实验脑基底动脉环分别与5，10和20μg/mL的mmLDL共培养，培养时间分别为6，12，24和48h，预实验显示1μL的DMSO加入1mL的DMEM不影响实验结果，为了考察mmLDL对ETB受体的作应机制，使用了信号转导通路的特异性拮抗剂，PKC通路拮抗剂选用0.1μMstaurosporine，ERK1/2通路拮抗剂为10μMU0126和10μMSB386023，U0126拮抗MAP激酶/ERK激酶1/2，即拮抗MAPKK；SB386023拮抗上游的MAPKKK，特异性的JNK通路拮抗剂为10μMSP600125，p38MAPK通路拮抗剂为10μM的SB203580，NF‑κB通路拮抗剂为10μM的wedelolactone，每一个拮抗剂均与mmLDL同时加入并共培养24h，然后，血管环置入浴槽做血管环张力实验，如果做RT‑PCR或者western blot实验，血管环放入液氮冷冻3小时然后存储于‑80℃冰箱；步骤二、动脉环肌张力实验将脑基底动脉环套在两个L型的金属针上，其中一个连接张力换能器，另一个连微调装置，通过软件Chart5.0以及硬件PowerLab 8通道桥式放大器，将血管所负荷张力显示于屏幕，将安装好的动脉环置入含有5ml Krebs液的37℃Myograph恒温浴槽，持续通入含95％O2和5％CO2的混合气体，pH保持7.4，实验前，脑基底动脉环静息负荷1.5mN，每20min换液一次，稳定1h，以含K+63.5mM的K+‑Krebs液检验动脉环收缩性，两次收缩高度大于1mN且收缩幅度相差＜10％者用于实验，在浴槽中浓度累加法加入10‑10M‑10‑7M的S6c，选择性激动ETB受体，可以得到ETB受体介导的量效曲线；步骤三、实时定量PCR总的RNA提取使用RNAfast200试剂盒，按照使用说明书提取，提取的RNA逆转录成cDNA使用GeneAmp RNA PCR试剂盒，按照说明书在Perkin‑Elmer公司的DNA热循环仪完成，RT‑PCR在GeneAmp5700扩增仪中进行，使用基因扩增的SYBR Green试剂盒，以cDNA为模版，设立对照组，除不加cDNA外，余平行操作，受体的特异性引物根据基因数据库应用引物表达‑2软件设计，大鼠ETB受体特异性引物，基因库编号NM_017333，设计如下：前引物：5′‑TGACGCCACCCACTAAGACC‑3′后引物：5′‑GGCACGGAGGAGGGAAGG‑3′Beta‑actin mRNA为官家基因，引物设计如下：前引物：5′‑ACTATCGGCAATGAGCGGTTCC‑3′后引物：5′‑CTGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG‑3′步骤四、Western blotting实验时取出存于‑80℃冰箱的脑基底动脉，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞提取变性缓冲液RIPA裂解液，匀浆，使用BCA蛋白分析试剂盒蛋白定量，使用SDS‑PAGE凝胶分离，电转膜仪转膜至PVDF膜，5％脱脂牛奶封闭，一抗为1∶100稀释的兔抗大鼠ETB受体抗体，和1∶500稀释的小鼠抗大鼠β‑actin抗体，稀释液为含2％牛血清白蛋白的PBS；二抗为辣根过氧化物酶标记的1∶2000稀释的抗兔IgG和1∶2000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG，图像经Image Gauge Ver.4.0，对光密度进行分析。...
【技术特征摘要】
1. 一种基于mmLDL上调脑基底动脉的ETB受体的方法，其特征在于，具体步骤为：步骤一、动脉环的制备及器官培养 SD大鼠用C02麻醉，断头处死，迅速取出大脑放入冷的碳酸氢盐缓冲液，取出脑基底动 脉，显微镜下剥离血管周围组织，血管内插入一根细线机械旋转去除内皮，将处理好的血管 切成1mm长的圆环，当乙酰胆碱引起的舒张率< 10%，认为内皮已被去除， 血管环在24孔板进行器官培养，每孔2个血管环，每孔加入含100 y g/ml链霉素、 100U/ml青霉素的培养液培养24h，在37°C，含5% C02和95% 02的培养箱内培养，由于器官 培养本身可以在脑基底动脉诱发ETB受体上调，在考察mmLDL对ETB受体的作用时将器官培 养组设为一个对照组，LDL组为另一个对照组，预实验脑基底动脉环分别与5,10和20 y g/ mL的mmLDL共培养，培养时间分别为6,12, 24和48h，预实验显示1 ii L的DMS0加入lmL的 DMEM不影响实验结果，为了考察mmLDL对ETB受体的作应机制，使用了信号转导通路的特异 性拮抗剂， PKC通路拮抗剂选用0? liiMstaurosporine，ERK1/2通路拮抗剂为10iiMU0126和 10iiMSB386023, U0126 拮抗 MAP 激酶/ERK 激酶 1/2,即拮抗 MAPKK;SB386023 拮抗上游 的MAPKKK，特异性的JNK通路拮抗剂为10 ii MSP600125, p38MAPK通路拮抗剂为10 ii M的 SB203580，NF_ k B通路诘抗剂为10 u M的wedelolactone，每一个诘抗剂均与mmLDL同时 加入并共培养24h，然后，血管环置入浴槽做血管环张力实验，如果做RT-PCR或者western blot实验，血管环放入液氮冷冻3小时然后存储于-80°C冰箱； 步骤二、动脉环肌张力实验 将脑基底动脉环套在两个L型的金属针上，其中一个连接张力换能器，另一个连微调 装置，通过软件Chart5.0以及硬件PowerLab 8通道桥式放大器，将血管所负荷张力显示 于屏幕，将安装好的动脉环置入含有5ml Krebs液的37°C Myograph恒温浴槽，持续通入含 95 % 02和5 % C02的混合气体，pH保持7. 4,实验前，脑基底动脉环静息负荷1. 5mN，每20min 换液一次，稳定lh，以含K+63. 5mM的K+-Krebs液检验动脉环收缩性，两次收缩高度大于lmN 且收缩幅度相差< 10%者用于实验， 在浴槽中浓度累加法加入lOiM-KTM的S6c，选择...
【专利技术属性】
技术研发人员：李洁，林杰，王俊杰，曹永孝，陈碧，
申请(专利权)人：李洁，林杰，王俊杰，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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