RNA纳米颗粒及其在胃癌防治中的应用制造技术

一种RNA纳米颗粒，由a链RNA、b链RNA和c链RNA按碱基配对规则形成颗粒，a链RNA序列为SEQ ID No.1，b链RNA序列为SEQ ID No.2，以及c链RNA序列为SEQ ID No.3。本发明专利技术提供的RNA纳米颗粒经细胞和动物水平的实验验证表明其具有良好的生物安全性，优异的基因干扰效果和专一性，能够有效的抑制胃癌细胞株和皮下移植瘤的生长，可应用于胃癌防治和诊断。

【技术实现步骤摘要】
RNA纳米颗粒及其在胃癌防治中的应用
本专利技术涉及一种生物纳米颗粒，尤其涉及一种RNA纳米颗粒，以其作为载体进行siRNA体内和体外递送的方法，以及以近红外染料标记后的RNA纳米颗粒在皮下瘤模型中的活体荧光成像中的应用
技术介绍
胃癌具有发病率高、易转移和病死率高等特点,根据临床统计,根治术后肿瘤的复发和转移率高达33％。在中国，胃癌发病率位于第二位，死亡率位于第三位。全球每年新发胃癌100余万，死亡约80万，中国每年新发胃癌占全球的42％，死亡占35％，其发病率和死亡率均是世界平均水平两倍多。胃癌起源于胃壁最表层的粘膜上皮细胞，可发生于胃的各个部位，可侵犯胃壁的不同深度和广度，胃癌的早期诊断和实时追踪胃癌细胞对胃癌的治疗至关重要。手术、化疗、放疗和生物靶向治疗是治疗恶性肿瘤的主要方法。中国专利技术专利申请201110045024.5公开了一种胃部淋巴结清楚方法，包括先切开肝胃韧带，清扫第12组肝十二指肠韧带淋巴结，再由幽门上方清扫第5组幽门上区淋巴结，并切断、结扎胃右动、静脉，再沿膈肌脚、肝尾状叶下缘将小网膜内膜组织切开，沿顺时针方向绕至贲门区右侧，清扫第1组贲门右淋巴结及第3组胃小弯淋巴结，再沿胰腺上缘处切开胰腺被膜，至幽门下方，清扫第6组幽门下淋巴结，与幽门上区会合；再沿肝总动脉干表面依次清扫第7组胃左动脉旁、第8组肝总动脉旁、第9组腹腔动脉旁及脾动脉干淋巴结，从而完成淋巴结的清除。该技术首次提出了以“围歼式”的淋巴结清扫方法，并采取更合理的清除途径，大大简化操作步骤，提高可操作性，减少清除过程对周围组织的损伤，显著降低创面，提高作业的安全性。但是，单纯的手术治疗对于胃癌病人的疗效是有限的，晚期病人或术后复发或转移者的主要治疗手段是化疗和放疗。随着胃癌分子生物学研究的不断深入，生物靶向治疗为胃癌的治疗开辟了新的途径。RNA干扰作为目前最为有效的基因沉默技术，在肿瘤的治疗中有着重大的应用前景，其能够特异性的阻断目标基因的表达，下调相应蛋白水平及功能，调控相关信号通路，从而抑制肿瘤生长、侵袭，具有分子特异性和选择性，能够专一性的杀灭肿瘤细胞，而对人体的正常组织没有损伤。然而裸露的小干扰RNA无保护，容易受机体内以及周围环境中的核酸酶的作用而降解，稳定性低，且因小干扰RNA具有过多阴离子而导致不能自由穿透细胞膜，达到靶组织时的剂量显著降低。因此，采用适当的递送系统将siRNA特异性的地送到靶细胞是siRNA治疗领域的挑战。因此发展一种安全、特异性的siRNA递送体系对于胃癌的治疗具有重大的意义。SalihGencer等人通过lipofectamin2000作为转染试剂将针对MMP-3基因的siRNA转入胃癌细胞株AGS中，有效的降低了AGS细胞的迁移以及浸润性(JournalofGastrointestinalandLiverDiseases.2011Mar；20(1):19-26)。此外，WeiZhou等人通过慢病毒作为载体将Akt1基因的siRNA转入胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823中，体内和体外的研究表明胃癌细胞对药物顺铂的敏感性明显增强(RegulatoryPeptides.2012Jun10；176(1-3):13-21)。上述两项技术中涉及的siRNA递送的载体lipofectamin2000和慢病毒在实际应用中受到lipofectamin2000较高的细胞毒性以及慢病毒潜在生物安全性的限制，尚难以实现在胃癌治疗中的得以应用。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种RNA纳米颗粒，生物相容性高，实现siRNA高效且特异性的递送。本专利技术的另一个目的在于提供一种RNA纳米颗粒，针对BRCAA1基因的沉默可有效抑制人胃癌细胞的增值并诱导细胞凋亡。本专利技术的再一个目的在于提供一种RNA纳米颗粒，将近红外染料标记的RNA纳米颗粒作为裸鼠胃癌皮下移植瘤模型的活体荧光成像的探针。本专利技术的又一个目的在于提供一种RNA纳米颗粒，用于胃癌的防治。本专利技术提供的一种RNA纳米颗粒，由a链RNA、b链RNA和c链RNA按碱基配对规则形成颗粒，其各自的序列分别为SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3，形成结构如下式Ⅰ所示本专利技术提供的另一种RNA纳米颗粒，由a链RNA、b链RNA和c链RNA组成，按碱基配对规则形成颗粒，其各自的序列分别为SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3，b链RNA5’端携带乳腺癌相关抗原基因1(Breastcancer-associatedantigen1，BRCAA1)的siRNA，该siRNA的有义链与b链RNA5’端相连，序列为SEQIDNo.4，其反义链序列为SEQIDNo.5，形成结构如下式Ⅱ所示。本专利技术提供的siRNA，出于保护稳定性的目的，还可在其上加上保护序列，如在其反义链和有义链的3’端上均加上两个u碱基组成的序列。本专利技术提供的RNA纳米颗粒，还在a链RNA的5’端标记叶酸。本专利技术提供的RNA纳米颗粒，还在c链RNA的5’端标记示踪剂，如：但不仅限于酶标记、荧光标记和同位素标记等，使得RNA纳米颗粒可用于生物体(活体)成像的探针，并制成检测试剂(盒)组合物。本专利技术提供的各种RNA纳米颗粒，能实现siRNA高效且特异性的递送和靶向递送，可用于制备胃癌防治的药物。本专利技术技术方案实现的有益效果：本专利技术提供的RNA纳米颗粒，由a链RNA、b链RNA和c链RNA等三种RNA按碱基配对规则形成纳米颗粒，生物相容性高，能实现siRNA高效且特异性的递送。本专利技术通过RNA纳米颗粒携带siRNA进入胃癌细胞,实现杀伤胃癌细胞以及抑制裸鼠皮下瘤生长。采用热动力稳定的RNA纳米颗粒作为载体携带BRCAA1基因的干扰RNA，并将叶酸作为靶标，实现对叶酸受体高表达的胃癌细胞株MGC-803细胞的特异性识别，并引起胃癌细胞的凋亡，增强了治疗效果。本专利技术提供的RNA纳米颗粒，在其携带示踪剂后，可作为生物体皮下移植瘤模型的活体成像探针，应用于胃癌的诊断和治疗。附图说明图1为本专利技术RNA纳米颗粒同时携带叶酸、示踪剂和针对BRCAA1基因的siRNA结构示意图；图2A为MGC-803细胞与AlexaFluor647和叶酸标记的RNA纳米颗粒共孵育后的流式分析图；图2B为GES-1细胞与AlexaFluor647和叶酸标记的RNA纳米颗粒共孵育后的流式分析图；图3A为采用荧光定量PCR实验验证RNA纳米颗粒对BRCAA1基因的沉默效果图；图3B为采用免疫印迹实验验证RNA纳米颗粒对BRCAA1基因的沉默效果图；图4为携带针对BRCAA1基因的siRNA的RNA纳米颗粒引起的MGC-803细胞的凋亡情况图；图5为携带针对BRCAA1基因的siRNA的RNA纳米颗粒对裸鼠皮下瘤的生长抑制情况与阴性和阳性对照组的比较图；图6A为静脉注射RNA纳米颗粒后分别在30分钟、3小时、5小时、12小时和24小时的活体荧光成像图，箭头指示的为肿瘤部位；图6B为静脉注射RNA纳米颗粒后分别在5小时、24小时、48小时、96小时和7天时的离体器官荧光成像图；图中，数字“1”表示肿瘤，数字“2”表示心脏，数字“3”表示肝脏，数字“4”表示脾脏，数字“5”表示肺，数字“6”表示胃，数字本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RNA纳米颗粒，由a链RNA、b链RNA和c链RNA按碱基配对规则形成颗粒，形成结构如下式Ⅰ所示所述的a链RNA序列为SEQ ID No.1；所述的b链RNA序列为SEQ ID No.2；所述的c链RNA序列为SEQ ID No.3。

【技术特征摘要】
1.一种RNA纳米颗粒，由a链RNA、b链RNA和c链RNA组成，按碱基配对规则形成颗粒，所述a链RNA序列为SEQIDNo.1；所述c链RNA序列为SEQIDNo.3；所述b链RNA序列为SEQIDNo.2，其5’端携带乳腺癌相关抗原基因1的siRNA，该siRNA的有义链与b链RNA5’端相连，...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔大祥，张春雷，郭培宣，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31