一种小分子合成抗菌肽及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开一种小分子合成抗菌肽及其制备方法与应用，所述阳离子抗菌肽序列为：SQ1:R-W-W-R-F-NH2(Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-NH2)，制备方法为固相化学合成法。本发明专利技术小分子合成抗菌肽具有对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌的广谱杀伤活性、较天然抗菌肽更强的杀菌活性；结构简单、人工合成方便、不需要任何修饰连接；且溶血毒性小、对动、植物细胞无任何毒害作用的优点，在抗菌药物的开发和应用方面有很重要价值。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开一种小分子合成抗菌肽及其制备方法与应用，所述阳离子抗菌肽序列为：SQ1:R-W-W-R-F-NH2(Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-NH2)，制备方法为固相化学合成法。本专利技术小分子合成抗菌肽具有对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌的广谱杀伤活性、较天然抗菌肽更强的杀菌活性；结构简单、人工合成方便、不需要任何修饰连接；且溶血毒性小、对动、植物细胞无任何毒害作用的优点，在抗菌药物的开发和应用方面有很重要价值。【专利说明】一种小分子合成抗菌肽及其制备方法与应用
本专利技术属于生物制药
，具体涉及一种小分子合成抗菌肽及其制备方法和 应用。
技术介绍
自从抗生素专利技术以来，人类在控制和治疗微生物感染中取得了巨大的成就。但随 着目前抗生素的持续使用，微生物抗药性已成为微生物感染控制的重大问题，以至于现在 某些微生物细菌已没有控制杀灭的物质，如在临床药物治疗中，万古霉素抗性的葡萄球菌、 肠球菌以及其他革兰氏阴性菌感染疾病，这些疾病的治疗均是世界范围内的难题。 抗菌肽是一类广泛存在于微生物及动植物体内的小分子多肽，通常由30多个氨 基酸残基组成，分子量为2-7KDa。抗菌肽的杀菌机制在于它能破坏细菌的细胞膜，致使细胞 内容物因高渗透压而溢出，最终导致细菌死亡。 抗菌肽因广泛的生物学活性而在医学上显示出良好的应用前景，但现有天然抗菌 肽在含量、抗菌活性和溶血作用等方面还存在缺陷。由于抗菌肽在动物体内含量极微，从动 物体内提取抗菌肽产量低、费时长、工艺复杂、费用昂贵，这成为制约天然抗菌肽进入实际 应用的最大障碍。 近年来，合成多肽在人体中的作用已越来越多地被科学界发现，其产生的医药效 果也引起了人们的高度关注。其中阳离子抗菌肽可以作为一类新型的抗生素，把细胞膜作 为主要靶点，通过在细胞膜上聚集并导致细胞通透性的增加，从而使细胞膜丧失其屏蔽功 能，进而导致细胞死亡。然而，目前公开的阳离子抗菌肽的结构复杂、抗菌活性较低且具有 较高的溶血毒性，因此，开发具有结构简单、抗菌活性高、化学合成容易且溶血毒性低特点 的阳离子抗菌肽迫不可待。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述不足，本专利技术的目的是提供一种结构简单、抗菌活性高 且溶血毒性低的小分子合成抗菌肽。 本专利技术还是提供一种快捷、简便制备上述小分子合成抗菌肽的方法。 本专利技术还提供所述小分子合成抗菌肽在药物中的应用。 为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种小分子合成抗菌肽，其特征在 于，在对天然抗菌肽的序列、结构分析的基础上设计并合成，其序列为：SQl: R-W-W-R-F-NH2 (Arg-Arg-Trp-Trp-Arg-NH2) 〇 所述小分子合成抗菌肽的制备方法，采用固相化学合成法从N末端到C末端合成， 具体步骤为： (1)抗菌肽的制备： 制备从N端到C端逐个进行，由多肽合成仪自动控制； 首先称量〇. Immol的结合了第一个氨基酸即Arg的树脂，装柱，再用20% (v/v)哌陡二 甲基甲酰胺溶液脱保护，然后用二甲基甲酰胺清洗，将用9-笏甲氧羰基（Fmoc)保护的氨基 酸Arg溶解于碳二亚胺（DCC)，并加入羟基苯并三唑（HOBt)/二异丙基乙基胺（DIPEA)，溶 解后的溶液在柱上循环偶合反应30min后，用三氟乙酸（TFA)清洗，并重复以上脱保护到偶 合反应步骤直到SQl序列中所有氨基酸均被接入，制备结束，以乙醚将三氟乙酸中的多肽 析出，清洗，形成固体粗品抗菌肽； (2)抗菌肽的纯化： 称量IOmg干燥后的固体粗品抗菌肽SQ1，溶于IOmL 0. 1% (v/v)的三氟乙酸（TFA)超 纯水溶液中；样品处理后用反相液相色谱（Vydac 218TP1022柱，2. 2X25cm)进行纯化，洗 脱液：流动相A为0. 1% (v/v)的三氟乙酸（TFA)超纯水溶液，流动相B为0. 1% (v/v)的乙 腈（ACN)超纯水溶液；洗脱梯度为：A相：5%?30% (v/v);流速15 mL/min，检测波长220nm， 进样体积为4 mL，收集洗脱峰；并将反相液相色谱（RP-HPLC)纯化出来的目标峰放置冻干 机中，在_50°C冻干后，再用质谱确认正确与否，HPLC检测纯度。 进一步，本专利技术还提供所述小分子合成抗菌肽在制备治疗细菌感染疾病药物中的 应用，以及在制备治疗革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌中的应用。 相比现有技术，本专利技术具有如下有益效果： (1)本专利技术小分子合成抗菌肽结构简单，不需要进行任何修饰连接，制备成本低廉，为 本专利技术大规模制备奠定了基础。 (2)本专利技术小分子合成抗菌肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有广谱杀伤活 性，并较天然抗菌肽具有更强的杀菌和抑菌活性。 (3)本专利技术小分子合成抗菌肽SQl高浓度下的溶血率非常低，表明本专利技术抗菌肽 的溶血毒性极小，为实际应用开发奠定了基础。 (4)本专利技术小分子合成抗菌肽SQl作用机制不同于传统抗生素，对实验的多种耐 药菌均有良好的抗菌作用，拟开发为一种抗耐药菌药物。 (5)本专利技术小分子合成抗菌肽SQl在琼脂孔穴扩散法测定体外活性时，能保持长 时间的抗菌活性，表明抗菌肽具有良好的抗水解能力。 【专利附图】【附图说明】 图1为本专利技术小分子合成抗菌肽SQl的质谱图。 【具体实施方式】 下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步详细说明。 实施例中，所有用于制备抗菌肽的试剂均购于美国应用生物系统公司，所有用于 活性测定试验的各种菌株均购于中国生物制品检定所。 本专利技术设计思想如下：经过多次试验后发现在Lactoferricin B4_9 (RRWQWR)基础 上，结合虚拟新合库设计技术，使用DNAstar，Bioedit，sequence logo等分析软件和网站， 通过氨基酸替换与截取后获得系列五肽分子，并经系列试验之后，发现该抗菌肽具有显著 抗菌活性，而且相比LfcinB6未出现溶血毒性，有望作为治疗细菌感染的新药研究和开发。 实施例1 : (1)小分子合成抗菌肽的制备（以制备〇. Immol量为例）： 制备从N端到C端逐个进行，由pioneer多肽合成仪自动控制。首先称量0. Immol的结 合了第一个氨基酸即Arg的树脂（购于美国应用生物系统公司），装柱，再用20%(v/v)哌啶 二甲基甲酰胺溶液脱保护，然后用二甲基甲酰胺清洗，将用9-笏甲氧羰基（Fmoc)保护的氨 基酸Arg溶解于碳二亚胺（DCC)，并加入羟基苯并三唑（HOBt)/二异丙基乙基胺（DIPEA)， 溶解后的溶液在柱上循环偶合反应30min后，用三氟乙酸（TFA)清洗，并重复以上脱保护到 偶合反应步骤直到SQl序列中所有氨基酸均被接入，制备结束，（具体操作步骤见pioneer 多肽合成仪操作指南），以乙醚将三氟乙酸中的多肽析出，清洗，形成固体粗品抗菌肽。 (2)抗菌肽的纯化： 称量一定量（IOmg)干燥后的固体粗品抗菌肽SQ1，溶于IOmL 0.1% (v/v)的三氟乙酸 (TFA)超纯水溶液中，样品处理后用反相液相色谱（Vydac 218TP1022柱，2. 2 X 25cm)进行 纯化，洗脱液：流本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小分子合成抗菌肽，其特征在于，在对天然抗菌肽的序列、结构分析的基础上设计并合成，其序列为：SQ1: R‑W‑W‑R‑F‑NH2 (Arg‑Arg‑Trp‑Trp‑Arg‑NH2)。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王远强，周朋朋，夏庆友，赵萍，林治华，丁元，钟晓武，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85