本发明专利技术公开一种端粒酶永生化牛甲状腺细胞系。本发明专利技术的牛甲状腺细胞系被命名为hTERT-BTY，并于2014年6月19日在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）进行保藏，保藏号为C2014109。本发明专利技术的细胞系可用于分离、检测和培养口蹄疫病毒。本发明专利技术的细胞系也可用作口蹄疫的牛源体外研究模型，或者用于制备口蹄疫病毒检测试剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种牛甲状腺细胞系及其用途和制备方法，确切讲本专利技术涉及一种端粒酶永生化牛甲状腺细胞系。
技术介绍
口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)是属于小 RNA 病毒科口蹄疫病毒属的单股正链RNA病毒，可感染偶蹄类动物并导致以口部、鼻子和蹄部等部位出现水泡为特征的急性、热性、高度传染性疾病。FMD被OIE列为法定必报病，在我国属于一类病，是危害畜牧业健康发展的“头号疫病”。 目前，口蹄疫病毒分离、检测、培养以及研究最为成功的实验模型体系主要是乳鼠和仓鼠肾细胞系(BHK-21)，其次是猪肾细胞系IBRS-2和PK-15。这些体系对不同毒株的敏感度各不相同，而且因为跨种分离培养，会引起病毒变异。有研究人员在牛源口蹄疫病毒分离检测时发现，病毒在原代牛甲状腺细胞(BTY)上的滴度比在上述其他体系中滴度更高，原代牛甲状腺细胞对口蹄疫病毒的敏感程度也比其他细胞高100-1000倍，参见:W.A.Snowdonj 1966.Growth of Foot-and-mouth Disease Virus in Monolayer Culture ofCalf Thyroid Cells.目前牛甲状腺细胞已经被用于口蹄疫查毒实验以及恶性卡他热等病毒的分离和研究。然而，原代BTY细胞可传至6-10代，随着增殖或冻存会使其敏感程度降低，在诊断和科学研究过程中，每次制备原代BTY细胞要宰杀胎牛来获取取甲状腺组织，不仅违背“动物福利”的初衷，而且是一项非常费时费力的工作，且批次之间往往差异较大。因此，以原代BTY细胞为基础，构建一个与原代BTY细胞特性一致的细胞系则能够为FMDV的分离培养、检测诊断以及基础研究提供极大的便利。 对FMDV的致病性研究主要针对牛和猪。牛FMD通常是通过呼吸道传播途径传播病毒而感染，病毒感染复制的初始部位是肺部或咽部，随即病毒快速分散到口腔、蹄上皮部位。反刍动物感染FMDV后，经过严重感染阶段有些动物可转归为持续感染状态。免疫动物在感染病毒后，也有可能转变为持续性感染动物。反刍动物的咽喉部(包括软颚)是FMDV持续感染部位，从FMD康复期的牛的食道-咽喉部(esophageal/pharyngeal, 0/P)刮取液中可以分离到活的FMDV。猪通常通过饲喂被FMDV污染的饲料或直接接触FMD感染动物或圈养过病畜的动物舍等而受感染。通过空气传播途径牛比猪更为易感，但猪感染后排毒量比牛或羊感染后排出的病毒量多。FMDV的不断进化造成其宿主嗜性、毒力以及抗原性等多种表型发生变异，形成大量表型各异的毒株，部分毒株出现与传统毒株不同的致病特性，不仅对牛羊具有严重的致病性，而且还具有对猪有很强的感染和致病性。若要深入比较阐明病毒的复制动力学、感染致病性以及调控和信号转导机制，除了动物本体实验，一个良好的体外研究模型是必不可少的，然而目前没有一种能够感染FMDV的牛源细胞系，因此构建一株能够感染FMDV的牛体细胞系是非常有必要的。
技术实现思路
本专利技术提供一种能够感染FMDV的牛源细胞系，该细胞系可作为FMDV对牛的致病性研究的一个优良模型，并可用于分离、检测和培养口蹄疫病毒，或者制备口蹄疫病毒检测试剂。 本专利技术的牛甲状腺细胞系被命名为1^1^了￥，并于2014年6月19日在中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏号为CCTCC No:C2014109。 本专利技术的细胞系可用于分离、检测和培养口蹄疫病毒。 本专利技术的细胞系也可用作口蹄疫病毒的牛源体外研究模型，或者用于制备口蹄疫病毒检测试剂。 本专利技术的细胞系的构建方法包括以下步骤:(O分离并培养原代犊牛甲状腺细胞；(2)在原代犊牛甲状腺细胞中转染pCIneo-hTERT质粒；(3)抗生素筛选获得能够稳定传代的犊牛甲状腺细胞并扩大培养。 在本专利技术的端粒酶永生化的犊牛甲状腺细胞的构建方法中，其步骤(I)中的原代犊牛甲状腺细胞是从0-24h龄健康犊牛甲状腺组织上分离培养的细胞。原代细胞培养取材对组织类型、分化程度、年龄等均有要求，一般胚胎组织较个体组织容易培养，分化低的较分化高的容易培养。由于牛的活胚胎很难获得，因此我们选用组织细胞分化程度较低的0-24h龄犊牛进行甲状腺细胞分离培养。 本专利技术的端粒酶永生化的犊牛甲状腺细胞系的构建方法中其步骤(2)中转染的质粒为pCIneo-hTERT。该质粒是将人端粒酶反转录酶基因连接到pCIneo载体(一种哺乳动物细胞稳定表达载体，为G418抗性)上构建而成，转染哺乳动物细胞能够使该细胞稳定表达端粒酶。细胞缺乏端粒酶导致分裂过程中端粒长度不断丢失是细胞衰老的主要机制之一，而导入外源性端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)基因可诱导细胞内端粒酶的活性，这样就可以使端粒长度保持稳定，延长细胞生存期并增强细胞增殖能力。激活端粒酶诱导细胞永生化类似于胚胎干细胞内存在的生理途径，最终能够获得与原代甲状腺细胞生物学行为接近、性状相对稳定的永生化细胞系。 本专利技术的端粒酶永生化犊牛甲状腺细胞系的构建方法中其步骤(3 )中筛选阳性克隆是采用G418药物进行筛选,转染24h后加压筛选抗生素浓度为400Pg/mL,筛选时间为15天；挑取单克隆后筛选抗生素浓度为200Pg/mL。加压筛选浓度是通过BTY细胞的G418杀伤曲线确定的，具体方法是未经转染的正常BTY细胞达到80%融合时加入含有G418的培养基，使用的G418浓度分别为50、100、200、400、80(^g/mL，每隔3天换含相应浓度G418的新鲜培养基。连续培养两周时细胞全部死亡所需的最低G418浓度为筛查阳性克隆所用的浓度。本实验中确定的筛选浓度为40(^g/mL，这样就能保证在不杀死阳性细胞的情况下最大程度的杀死阴性细胞。单克隆出现后G418浓度减半继续筛选，直到细胞维持稳定的G418抗性。 在本专利技术的端粒酶永生化犊牛甲状腺细胞系的构建方法中，对犊牛甲状腺细胞系特征基因促甲状腺激素受体基因TSHR以及钠/碘转运子NIS检测方法是通过RT-PCR进行的，所使用的扩增引物分别为:SEQ ID No, 1、SEQ ID No，2、SEQ ID No，3 和 SEQ ID No，4。以上引物是根据牛TSHR和NIS全基因序列设计的，分别检测这两个基因中的其中一段，PCR产物测序后与全基因序列进行比对，比对结果同源性均为95%以上。 本专利技术具有以下有益效果:(I)细胞缺乏端粒酶导致分裂过程中端粒长度不断变短，这是细胞衰老的主要机制之一，外源性导入端粒酶逆转录酶基因可诱导细胞内表达端粒酶，从而使端粒长度保持稳定不变，延长细胞的生存期并增强细胞的增殖能力。端粒酶诱导细胞永生化的方法是一种类似于胚胎干细胞原理的接近生理过程的途径，使细胞发生不可预知的突变的可能性较小，这样就为获得理想的FMDV体外研究模型提供了有力的保障。本专利技术是选取人端粒酶催化亚单位hTERT转染原代牛甲状腺细胞激活端粒酶的方法构建牛甲状腺细胞系，本专利技术的细胞系仍然保持原代牛甲状腺细胞的特性，能够高水平表达牛甲状腺特异性基因。 (2)染色本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种牛甲状腺细胞系，该细胞系命名为hTERT‑BTY，CCTCC保藏号为C2014109。
【技术特征摘要】
1.一种牛甲状腺细胞系，该细胞系命名为hTERT-BTY，CCTCC保藏号为C2014109。2.如权利要求1所述细胞系的用途，其特征在于分离、检测和培养口蹄疫病毒中的应用。3.如权利要求1所述细胞系的用途，其特征在于用作口蹄疫病毒的牛源体外研究模型。4.如权利要求1所述细胞系的用途，其特征在于制备口蹄疫病毒检测试剂中的应用。5.权利I所述的细胞系的构建方法，其特征在于所述方法包括以下步骤: (O分离并培养原代犊牛甲状腺细胞； (2)在原代犊牛甲状腺细胞中转染pCIneo-hTERT质粒； (3)抗生素筛选获得能够稳定传代的犊牛甲状腺细胞并扩大培养。6.根据权利要求5所述的端粒酶永生化的犊牛甲状腺细胞的构建方法，其特征在于所述步骤(I)中的原代犊牛甲状腺细胞是从0-24h龄健康犊牛甲状腺组织上分离培养的细胞。7.根据权利要求6所述的端粒酶永生化的犊牛甲状腺细胞系的构建方法，其特征在于所述步骤(2)中转染的质粒为pCIneo-hTERT。8.根据权利要求7所述的端粒酶永生化犊牛甲状腺细胞系的构建方法，其特征在于所述步骤(3...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，毛箬青，田宏，杨帆，曹伟军，朱紫祥，李丹，连凯琪，靳野，郭建宏，何继军，刘湘涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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