本发明专利技术公开了一种特异结合胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9051。本发明专利技术还公开了该单克隆抗体的制备方法。本发明专利技术还公开了一种体外化学标记处理的该单克隆抗体。本发明专利技术还公开了竞争ELISA检测胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗体试剂盒。本发明专利技术的竞争ELISA试剂盒检测样品可以在1h内完成，比目前的商品化间接ELISA检测试剂盒快0.5h，比检验检疫行业标准使用的阻断ELISA快1.5h，一天内可以完成多批次样品检测，符合疫病快速诊断的要求。
【技术实现步骤摘要】
特异结合胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原的单克隆抗体及 试剂盒
本专利技术属于生物技术和动物检疫
，具体涉及一种特异结合胸膜肺炎放线 杆菌血清7型抗原的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞系，此外，本专利技术还涉及一种竞争 ELISA检测胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗体试剂盒。
技术介绍
猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumoniae)是由胸膜肺炎放线 杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，简称App)引起的猪的一种呼吸道传染病，具有 高度传染性，多呈最急性或急性病程而迅速致死，其发病率和死亡率都在50%以上，最急性 型的死亡率可高达80-100%，慢性型可导致猪生长缓慢，成为僵猪，该病是集约化猪场常见 猪病之一，是我国进口种猪检疫的猪病之一。我国曾多次从美国、丹麦、英国等进口种猪中 检出猪传染性胸膜肺炎。根据胸膜肺炎放线杆菌可溶性抗原荚膜多糖和脂多糖抗原性的差 异，可将其分为15个血清型。血清学抗体检测是最重要的诊断方法之一。 由于App各型之间没有完全的交叉保护，App每个血清型的毒力不同，每个血清 型在各个国家的分布也不同，因此，准确诊断感染血清型是预防和控制该病的基础。App血 清7型是重要的致病血清型，我国从美国、加拿大进口种猪都要求检疫此血清型。根据吉 林大学雷连成等从我国长春分离的App菌株毒力测定，血清7型对小鼠的致死率很高，达 66. 5%。 ELISA检测方法方便、快速、敏感、特异，是抗体检测最常用的方法。 此检测方法不需要昂贵的仪器，几乎所有的检测单位都备有ELISA仪，ELISA试剂 盒很容易推广应用。就App而言，目前国内外商品化ELISA检测试剂盒还没有只检测血清 7型抗体的试剂盒。也没有采用竞争ELISA检测App抗体的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是提供能与App血清7型抗原特异结合的单克隆抗 体。 本专利技术要解决的技术问题之二是提供分泌产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞系。 本专利技术要解决的技术问题之三是提供本专利技术的单克隆抗体的制备方法。 本专利技术要解决的技术问题之四是提供一种体外化学标记过的单克隆抗体。 本专利技术要解决的技术问题之五是提供基于上述单克隆抗体研制的竞争ELISA检 测胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗体试剂盒。 本专利技术是通过以下技术方案实现的： 在本专利技术的一方面，提供一种分泌特异结合胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原的单 克隆抗体的杂交瘤单克隆细胞，代号为SHCIQ-S7-8D12杂交瘤细胞株，经间接ELISA和竞争 ELISA检测，证实其所分泌的单克隆抗体能够特异识别并结合胸膜肺炎放线杆菌血清7型 抗原。该杂交瘤细胞株已于2014年4月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心（简称为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 9051，保藏地点：中国，北京。 在本专利技术的另一方面，提供一种特异结合胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原的单克 隆抗体，由上述保藏编号为CGMCC No. 9051的杂交瘤细胞系分泌产生。 本文所采用的术语单克隆抗体（单抗）指从一纯系细胞得到的免疫球蛋白，具 有相同的结构和化学特性，对单一抗原决定簇有特异性。单克隆抗体与常规多克隆抗体制 剂（通常是具有针对不同决定簇的不同抗体）不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决 定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤或重组工程细胞 培养获得，不会混杂有其它免疫球蛋白。修饰语单克隆表示了抗体的特性，是从均一的 抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。 本文所采用的术语杂交瘤细胞系（英文名称：hybridoma cell line)，指从杂交 瘤细胞中筛选培养出的细胞系。 在本专利技术的另一方面，提供一种上述单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤： 步骤1、制备免疫原：配制巧克力培养基，将胸膜肺炎放线杆菌血清7型标准菌株 复苏，大量培养，用生理盐水洗菌，离心，弃上清，细菌沉淀用生理盐水洗悬浮，离心，生理盐 水悬浮的S7细菌全抗原作为免疫原； 步骤2、小鼠免疫：通过反复多次小剂量的小鼠皮下免疫，挑选可分泌高效价的抗 App血清7型多克隆抗体的小鼠； 步骤3、细胞融合：取免疫小鼠脾脏细胞,通过体外与小鼠骨髓瘤细胞融合； 步骤4、阳性杂交瘤细胞筛选：用间接ELISA试验筛选抗胸膜肺炎放线杆菌血清7 型抗原的阳性杂交瘤细胞； 步骤5、阳性杂交瘤细胞的获得：选择强阳性反应的杂交瘤细胞，用有限稀释法连 续克隆3次，最后一次克隆后检测为阳性的孔所得细胞株即为稳定分泌的、特异的抗胸膜 肺炎放线杆菌血清7型抗体的杂交瘤细胞株； 步骤6、杂交瘤细胞的培养与保存：将阳性杂交瘤细胞扩增培养，收集细胞；一部 分用于生产小鼠腹水抗体，另一部分液氮保存。 作为本专利技术优选的技术方案，步骤1具体为：配制巧克力培养基，将胸膜肺炎放线 杆菌血清7型标准菌株复苏，大量培养，用生理盐水将菌洗下，8000r/min离心lOmin，弃上 清，细菌沉淀用生理盐水洗悬浮，离心，如此洗菌3次。细菌沉淀用含0. 5%甲醛生理盐水悬 浮，放置4°C过夜灭活，8000r/min离心lOmin去除甲醛，用生理盐水洗3次。生理盐水悬浮 的S7细菌全抗原作为免疫原； 作为本专利技术优选的技术方案，步骤2具体为：将上述免疫原与等体积的福氏完全 佐剂混合乳化，对8周龄的BALB/C雌鼠做腹腔注射，3-4周后用同样免疫原乳化在福氏不完 全佐剂中，作第二次腹腔注射，2-3周后用加倍剂量的免疫原作最后一次腹腔注射，三天后 取小鼠脾脏用于细胞融合。 作为本专利技术优选的技术方案，步骤3具体为：取免疫小鼠脾脏细胞，通过体外与 小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5-10:1的比例在50% PEG下融合，用HAT培养基筛选；融合细 胞培养5d后，用HAT培养基再换液一次，第10d用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔低 5% -30%时，取上清用间接ELISA方法筛选。 作为本专利技术优选的技术方案，步骤4中，筛选时包被抗原为App S7型经反复冻融 3次处理的抗原，所述抗原以1:5000稀释，并以其它血清型的App为阴性对照。 此外，在本专利技术的另一方面，还提供一种体外化学标记处理的上述抗胸膜肺炎放 线杆菌血清7型抗原的单克隆抗体。 所述体外化学标记处理的步骤如下： 1)将腹水单克隆抗体用硫酸铵纯化； 2)用改良过碘酸钠法将抗体与HRP偶联，盐析法去除样品中未结合的HRP，最终产 物对PBS透析过夜，即得到体外化学标记过的辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体。 改良过碘酸钠法可参考韩文瑜等主编的病原细菌检验技术（吉林科学技术出版 社1992年7月第1版P204)，主要步骤如下： (1)将5mgHRP溶于0. 5ml蒸馏水中，加入新配制的0. 06mol/L NaI04水溶液 0. 5ml，混匀置冰箱中30min。 (2)加入0· 16mol/L乙醇水溶液0· 5ml，置室温放置30min。 (3)加入含5mg纯化抗体的水溶液1m本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分泌特异结合胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其保藏编号为CGMCC No.9051。
【技术特征摘要】
1. 一种分泌特异结合胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞系， 其保藏编号为CGMCC No. 9051。2. -种特异结合胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗原的单克隆抗体，由权利要求1所述的 杂交瘤细胞系分泌产生。3. -种如权利要求2所述单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤： 步骤1、制备免疫原：配制巧克力培养基，将胸膜肺炎放线杆菌血清7型标准菌株复苏， 大量培养，用生理盐水洗菌，离心，弃上清，细菌沉淀用生理盐水洗悬浮，离心，生理盐水悬 浮的S7细菌全抗原作为免疫原； 步骤2、小鼠免疫：通过反复多次小剂量的小鼠皮下免疫，挑选可分泌高效价的抗App 血清7型多克隆抗体的小鼠； 步骤3、细胞融合：取免疫小鼠脾脏细胞,通过体外与小鼠骨髓瘤细胞融合； 步骤4、阳性杂交瘤细胞筛选：用间接ELISA试验筛选抗胸膜肺炎放线杆菌血清7型抗 原的阳性杂交瘤细胞； 步骤5、阳性杂交瘤细胞的获得：选择强阳性反应的杂交瘤细胞，用有限稀释法连续克 隆3次，最后一次克隆后检测为阳性的孔所得细胞株即为稳定分泌的、特异的抗胸膜肺炎 放线杆菌血清7型抗体的杂交瘤细胞株； 步骤6、杂交瘤细胞的培养与保存：将阳性杂交瘤细胞扩增培养，收集细胞；一部分用 于生产小鼠腹水抗体，另一部分液氮保存。4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1具体为：配制巧克力培养基，将 胸膜肺炎放线杆菌血清7型标准菌株复苏，大量培养，用生理盐水将菌洗下，8000r/min离 心lOmin，弃上清，细菌沉淀用生理盐水洗悬浮，离心，如此洗菌3次。细菌沉淀用含0. 5%甲 醛生理盐水悬浮，放置4°C过夜灭活，8000r/min离心lOmin去除甲醛，用生理盐水洗3次。 生理盐水悬...
【专利技术属性】
技术研发人员：李树清，陈志飞，张强，王巧全，林颖峥，刘雨潇，吴建详，陆承平，宋青，唐智芳，
申请(专利权)人：中华人民共和国上海出入境检验检疫局，南京农业大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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