本发明专利技术提供了胸膜肺炎放线杆菌血清4型PCR检测用引物及其试剂盒，属于生物技术领域。以基因组DNA为模板，利用所提供引物进行PCR扩增，反应结束后根据扩增片段的数量和分子量大小判定结果。本发明专利技术的引物特异性好，检测方法快速简单，灵敏度高，不仅可从细菌培养液，也能直接从病料中检测胸膜肺炎放线杆菌血清4型，可用于胸膜肺炎放线杆菌血清4型的分子流行病学调查、疫病诊断及疫苗菌株的筛选。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及胸膜肺炎放线杆菌血清4型检测用引物及其检测试剂盒，属于生物技 术领域。
技术介绍
猪传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎 放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一种猪传染性呼吸道疾病，给 世界养猪业造成了严重的经济损失。该病于1957年由Pattison等首次报道，此后逐渐扩 散，目前已遍布世界各地。我国于1987年首次报道本病的临床病例，近年来发病率日益增 尚。 根据荚膜多糖和菌体脂多糖的不同，APP至少可以分成15个血清型（1 一 15)，血 清5型又分为S5a和S5b 2个亚型。不同国家流行的血清型不同。在我国，流行的APP血 清型较多，已分离到1、2、3、4、5、7、8、9和10型。各血清型之间毒力不同，相互之间交叉保 护性也很低。对血清型的准确鉴定，可更针对性地预防和控制猪传染性胸膜肺炎。 目前对APP的分型的常用方法有凝集试验和PCR方法。凝集试验需要各个血清型 的特异抗血清，且有的血清型之间有交叉反应，影响结果的准确性，这些都限制了这个方法 在一般实验室的应用。而PCR方法因具有更高的可操作性、敏感性和特异性，应用更广泛。 目前已经有针对APP血清1、2、3、5、7、8、10型的PCR检测方法的报道，但国内外尚 无检测APP血清4型的PCR方法。建立能够快速而特异的检测APP血清4型的PCR检测方 法势在必行。 因此，基于以上的研究和当前的需求，申请人根据胸膜肺炎放线杆菌血清4型荚 膜多糖合成基因，设计并合成了 1对检测胸膜肺炎放线杆菌血清4型的引物，采用PCR方法 扩增APP CPS4C基因，通过扩增片段的数量和分子量大小，来判定是否含有胸膜肺炎放线杆 菌血清4型，从而特异、敏感、省时、省力、低成本地检测胸膜肺炎放线杆菌血清4型。该技 术不仅可从细菌培养物，也能直接从病料中检测胸膜肺炎放线杆菌血清4型，可用于分子 流行病学调查、疫病诊断及疫苗菌株的筛选。
技术实现思路
技术问题 本专利技术的目的在于提供胸膜肺炎放线杆菌血清4型检测用引物及其试剂盒。 技术方案 胸膜肺炎放线杆菌血清4型PCR检测用引物，包括 APP-CPS4CF(SEQ ID NO. 1) :5, -GCTAGAAATGGCAAATGAAA-3,； APP-CPS4CR(SEQ ID NO. 2) :5' -CTGGACGAGTAATAAATGAA-3' ； 该引物能从胸膜肺炎放线杆菌血清4型菌株提取的基因组DNA中扩增出653bp DNA片段。该引物能在制备胸膜肺炎放线杆菌血清4型PCR检测试剂盒中得到应用。 本专利技术还提供了一种用于检测胸膜肺炎放线杆菌血清4型的试剂盒，该试剂盒含 有上述引物 SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2。 具体的，该试剂盒包括： (I)PCR 反应液： 2\PCR Mix i2.5liL ?〇μΜ SEQ ID ΝΟ.? 1,0μL_. ΙΟμΜ SEQ ID ΝΟ.2 Ι.ΟμL 无菌超纯水 8.5μΙ_. 混匀后置-20 °C保存。 ⑵阴性对照：无菌超纯水，置_20°C保存。 (3)阳性对照：胸膜肺炎放线杆菌血清4型参考菌株M62基因组DNA，置-20°C保 存。 试剂盒用于检测胸膜肺炎放线杆菌血清4型的方法包括： (1)样品处理 待检细菌样品处理：取ImL待检细菌培养液于I. 5mLEP管中，12000rpm，离 心5min，弃上清，沉淀用IOOyL裂解缓冲液重悬，其中裂解缓冲液为：0.0005 %吐 温-20, 0· 50g/L 蛋白酶 K 和 0· lmol/L Tris，ρΗ8· 5 ; 或者肺组织样品处理：取Ig疑似感染猪肺脏组织，加入1ml PBS制成悬液； 2000rpm，离心2min，取500 μ L上清液于I. 5mLEP管中，12000rpm,离心5min，弃上清，沉淀 用IOOuL上述裂解缓冲液重悬； (2)基因组DNA的提取：将上述用100 μ L裂解缓冲液重悬的液体置57°C水浴Ih 后，100°C作用5min，再12000rpm离心10min，上清即为基因组DNA，-20°C冻存备用； (3)PCR 扩增：在 25 yL 反应体系中加入 2XPCR MIX 12. 5 yL，SEQ ID NO. 1 I. 0 μ L，SEQ ID NO. 2 I. 0 μ L，DNA 2· 0 μ L，无菌超纯水 8· 5 μ L ; ?0?反应条件：951€51^11预变性后，941€3〇8,54.8 1€3〇8,721€458,30个循环后， 72°C延伸 IOmin ; (4)判定胸膜肺炎放线杆菌血清4型的方法： 被检样品电泳出现一条与阳性对照大小相同的扩增片段653bp，则判定为胸膜肺 炎放线杆菌血清4型阳性； 被检样品电泳不出现扩增片段653bp，则判定为胸膜肺炎放线杆菌血清4型阴性。 有益效果 本专利技术根据GenBank上公布的胸膜肺炎放线杆菌4型参考菌株M62的全基因组序 列中找到与血清分型相关的7个荚膜多糖生物合成相关基因和10个菌体脂多糖0抗原生 物合成基因簇基因，在NCBI网站上进行大量序列比对，找到了 1个与其它基因型菌株序列 完全不相同的基因，即APP CPS4C基因。 以APP CPS4C基因序列为靶标，在其保守区设计引物，经过大量筛选设计了本专利技术 的引物，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2,通过多次优化PCR反应 条件，建立了胸膜肺炎放线杆菌血清4型PCR检测方法。该对引物从胸膜肺炎放线杆菌血 清4型细菌培养液和感染胸膜肺炎放线杆菌血清4型的病料提取的基因组DNA中都可扩增 出653bp DNA片段。 本专利技术的检测引物和试剂盒具有特异性高的特征，检测其他15种APP参考菌株、 对猪致病的主要细菌（副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪肺疫巴氏杆菌、猪丹毒杆菌、猪葡萄球 菌、猪沙门氏菌、猪大肠杆菌、猪肺炎支原体）和病毒（猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病 毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪流感病毒）以及健康猪肺组织的基因组DNA或cDNA都 为阴性。 本专利技术的检测引物和试剂盒具有灵敏度高的特征，对APP血清4型的检测灵敏度 可达到 100CFU/mL。 本专利技术的检测引物和试剂盒为APP分子流行病学调查、疫病诊断及疫苗菌株的筛 选提供有效的工具。【附图说明】 图1是50°C~65°C梯度PCR产物电泳结果，其中M :DL2000 DNA Marker ;退火温度 I. 50°C ；2. 50. 7°C ；3. 51. 5°C ；4. 53〇C ；5. 54. 8°C ；6. 56. 6°C ；7. 58. 4°C ；8. 60. 2°C ； 9. 62〇C ；10. 63. 5°C；11. 64. 2°C ；12. 65〇C 图2是退火温度为51. 5 °C PCR产物电泳结果，其中M :DL2000 DNA Marker ; 1. SI ；2. S2 ；3. S3 ；4. S4 ；5. S5a ；6. S5b ；7. S6 ；8. S7 ；9. S8 ；10. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
胸膜肺炎放线杆菌血清4型PCR检测用引物，包括APP‑CPS4CF(SEQ ID NO.1)：5’‑GCTAGAAATGGCAAATGAAA‑3’；APP‑CPS4CR(SEQ ID NO.2)：5’‑CTGGACGAGTAATAAATGAA‑3’；该引物能从胸膜肺炎放线杆菌血清4型菌株提取的基因组DNA中扩增出653bp DNA片段。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：倪艳秀，何孔旺，周俊明，祝昊丹，孙学飞，吕立新，俞正玉，茅爱华，张雪寒，温立斌，李彬，郭容利，王小敏，汪伟，胡屹屹，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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