本发明专利技术公开了一种羊传染性胸膜肺炎等温PCR病原现场快速检测试剂盒，由一套引物、10倍环介导等温扩增反应液、逆转录酶、DNA聚合酶(Bst DNA酶)、阳性对照、阴性对照和显色剂组成；所述的一套引物是由一对引物和一对内引物组成。采用本发明专利技术可以定性定量检测传染性胸膜肺炎。本发明专利技术利用Bst DNA酶的链置换特性，设计4条引物，识别靶序列的6个区域，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构，在定性检测时不需任何特殊设备，只需眼观反应管道颜色变化即可判定，因此具有特异性、敏感性高和检测时间比普通PCR短、适用于羊场现场的快速检测等特点。
【技术实现步骤摘要】
一种羊传染性胸膜肺炎等温PCR病原现场快速检测试剂盒
本专利技术属于生物工程
，涉及一种羊传染性胸膜肺炎等温PCR病原现场快 速检测试剂盒。
技术介绍
绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，MO)是引起绵羊、山羊，特别是盖 羊传染性胸膜肺炎（增生性间质性肺炎）的病原体。感染绵羊肺炎支原体的羊主要表现咳 嗽、流鼻涕、消瘦、贫血、生长发育迟缓等，患该病的羊只病程可达数月至数年，并可造成出 栏率、毛质和毛量的下降以及饲料和人力大量的浪费。同时患该病的羊只由于免疫力的下 降还能诱发其他病原的继发或混合感染，造成死亡率上升，给养羊业带来重大的经济损失。 虽然绵羊支原体肺炎的感染范围和严重程度是低于山羊传染性胸膜肺炎的，且不是致死性 的，但此病的分布范围是非常广的，几乎遍布世界上所有的养羊国家和地区，尤其是在养羊 业占畜牧业的比重较大的中东、西亚和非洲等不发达的国家较为常见，而且此病在全世界 有蔓延的趋势，给养羊业造成了巨大的经济损失，所以对引发该疾病的病原体MO的研究日 益受到人们的重视。近年来，绵羊支原体已在我国广泛分布和流行，危害日趋严重，已成为 危害养羊业的一种重要传染病，我国的内蒙古、陕西、辽宁、宁夏、新疆、甘肃、西藏、四川、河 北等主要的养羊地区相继爆发了绵羊、山羊的传染性胸膜肺炎，对我国的养羊产业产生了 严重的影响。 目前，用于检测MO的方法主要有病原的实验室分离培养法、电镜法、血清学方法、 核酸探针法和PCR法等其中，PCR法是最为敏感的一种检测方法，明显优于分离培养、生化 鉴定、免疫突光检测和ELISA等方法。然而，上述方法存在检测周期长（实验室分离培养 法）、需要特殊的仪器设备（电子显微镜、PCR仪）等原因，而不适合临床的快速检测的要 求。 由于MO的16S rRNA序列测定的较多，是MO最为保守的核酸序列，且具有支原体 种特异性，因此目前普遍是把MO的rRNA基因作为靴序列设计引物，通过PCR检测鉴定M0， 为能够对该病进行快速诊断，从而建立一种有效的基因检测方法。 环介导等温PCR是利用Bst DNA酶的链置换特性，设计4条引物，识别靶序列的6 个区域，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构，在定性检测时不需任何特殊设备，只需 眼观反应管道颜色变化即可判定，因此具有特异性、敏感性高和检测时间比普通PCR短、适 用于羊场现场的快速检测等特点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种羊传染性胸膜肺炎等温 PCR病原现场快速检测试剂盒，本专利技术的试剂盒由一套设计的引物、10 X LAMP反应液、逆转 录酶、DNA聚合酶（Bst DNA酶）、阳性对照、阴性对照和显色剂组成。采用本专利技术可以定性 检测传染性胸膜肺炎。本专利技术利用Bst DNA酶的链置换特性，设计4条引物，识别靶序列的 6个区域，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构，在定性检测时不需任何特殊设备，只 需眼观反应管道颜色变化即可判定，因此具有特异性、敏感性高和检测时间比普通PCR短、 适用于羊场现场的快速检测等特点。本专利技术的目的具体体现在以下几个方面： 1.常规PCR检测技术相比本技术速度慢，从采样到出结果最少需要48h，本技术仅 需30-90分钟； 2.常规PCR需要需要PCR仪、电泳系统、凝胶成像系统等大型、昂贵的仪器设备本 技术仅需要一个恒温箱或保温杯即可； 3.常规PCR的结果必须在凝胶成像仪下观察，本技术的试剂盒反应完毕后肉眼即 可判定结果； 4.本试剂盒检测的敏感性、特异性比常规PCR更高。 其具体技术方案为： 一种羊传染性胸膜肺炎等温PCR病原现场快速检测试剂盒， 由一套引物、10倍环介导等温扩增反应液、逆转录酶、DNA聚合酶（Bst DNA酶）、 阳性对照、阴性对照和显色剂组成；所述的一套引物是由一对引物和一对内引物组成，其序 列为： 引物 I :GCGGAGGCTAACGAGATG 引物 2 :CCATTGTAGCACGTGTGTTG 内引物 I : CGCTCGTTGCAGGACTTAACCT-ACAGATGGTGCATGGTTGT 内引物 2 : CCGGTGCAAACCGGAGGAAG-CCCACTCGTAAGAGGCATGA 其中，所述的一对引物与一对内引物的摩尔数之比为1 : 6?9 ;所述的DNA聚合 酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活力为8个活性单位/微升；所述的阳性对照为含 有插入绵羊支原体模式株（Y98)16S rRNA-段特异序列的阳性质粒，环介导等温扩增反应 扩增区位于该特异序列中，其浓度为IO7拷贝/μ L ;所述的阴性对照为灭菌双蒸水；所述的 显色剂为20倍SYBR Green I。 优选地，所述的10倍环介导等温扩增反应液是由200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐 酸盐、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、40?100mmol/L硫酸镁、4?IOM甜菜碱、5? 18mmol/L的dNTPs和质量百分浓度0. 1%的Triton X-100组成。 优选地，所述的dNTPs为含有四种dNTP的等量混合物。 优选地，所述的阳性质粒的制作方法为：采用PCR扩增一段绵羊支原体模式株 (Y98)16S rRNA基因特异序列，然后装入PMD18-T载体，转化至DH5a感受态细菌，抽取质 粒DNA经序列确定后，采用紫外分光光度计测定质粒DNA的浓度并用灭菌双蒸水调整拷贝 数至 107拷贝/yL。 优选地，所述的SYBR Green I为高灵敏度的DNA荧光染料。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果为： 1、本专利技术利用Bst DNA酶的链置换特性，设计4条引物，识别靶序列的6个区域， 在等温条件下生成大量重复的茎环状结构，在定性检测时不需任何特殊设备。 2、本专利技术的特异性、敏感性均高于普通PCR技术。 3、本专利技术由于不需经过PCR技术的3个温度的重复循环，检测时间比PCR短。 4、本专利技术的结果判断不需经电泳，比PCR简单，极易推广。对于定量检测，虽然借 助了荧光定量PCR仪，但不需合成荧光探针，只需借助荧光染料SYBR Green I，成本大大减 低。 5、本专利技术的反应温度在60°C?65°C左右，且识别靶基因6个特定区域，引物多聚 体及非特异性扩增几率大大降低，定量准确性大大提高。 【具体实施方式】 下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。 一种羊传染性胸膜肺炎等温PCR病原现场快速检测试剂盒，包括以下步骤： 由一套引物、10倍环介导等温扩增反应液、逆转录酶、DNA聚合酶（Bst DNA酶）、 阳性对照、阴性对照和显色剂组成；所述的一套引物是由一对引物和一对内引物组成，其序 列为： 引物 1 如 SEQ :ID :1 所示：GCGGAGGCTAACGAGATG 引物 2 如 SEQ :ID :2 所示：CCATTGTAGCACGTGTGTTG 内引物1如SEQ :ID :3所示： CGCTCGTTGCAGGACTTAACCT-ACAGATG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种羊传染性胸膜肺炎等温PCR病原现场快速检测试剂盒，其特征在于，由一套引物、10倍环介导等温扩增反应液、逆转录酶、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成；所述的一套引物是由一对引物和一对内引物组成，其序列为：引物1：GCGGAGGCTAACGAGATG引物2：CCATTGTAGCACGTGTGTTG内引物1：CGCTCGTTGCAGGACTTAACCT‑ACAGATGGTGCATGGTTGT内引物2：CCGGTGCAAACCGGAGGAAG‑CCCACTCGTAAGAGGCATGA其中，所述的一对引物与一对内引物的摩尔数之比为1∶6～9；所述的DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活力为8个活性单位/微升；所述的阳性对照为含有插入绵羊支原体模式株Y98 16S rRNA一段特异序列的阳性质粒，环介导等温扩增反应扩增区位于该特异序列中，其浓度为107拷贝/μL；所述的阴性对照为灭菌双蒸水；所述的显色剂为20倍SYBR Green I。
【技术特征摘要】
1. 一种羊传染性胸膜肺炎等温PCR病原现场快速检测试剂盒，其特征在于， 由一套引物、10倍环介导等温扩增反应液、逆转录酶、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照 和显色剂组成；所述的一套引物是由一对引物和一对内引物组成，其序列为： 引物 1 :GCGGAGGCTAACGAGATG 引物 2 :CCATTGTAGCACGTGTGTTG 内引物 1 :CGCTCGTTGCAGGACTTAACCT-ACAGATGGTGCATGGTTGT 内引物 2 :CCGGTGCAAACCGGAGGAAG-CCCACTCGTAAGAGGCATGA 其中，所述的一对引物与一对内引物的摩尔数之比为1 : 6?9;所述的DNA聚合酶为 具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活力为8个活性单位/微升；所述的阳性对照为含有插 入绵羊支原体模式株Y98 16S rRNA-段特异序列的阳性质粒，环介导等温扩增反应扩增区 位于该特异序列中，其浓度为1〇7拷贝/μ L ;所述的阴性对照为灭菌双蒸水；所述的显色剂 为 20 倍 SYBR Green I。2. 根据权利要求1所述的羊传染性胸...
【专利技术属性】
技术研发人员：敬晓棋，黄光东，张琼，陈生叶，
申请(专利权)人：陕西溯源农业发展有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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