一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法技术

一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，步骤为：一、对刺柏属物种的干燥叶片或种子，进行叶片总DNA或种子胚乳DNA的提取；二、对检测合格的DNA样品，利用核基因Chi1引物进行PCR扩增和测序；三、PCR扩增产物的纯化；四、对纯化产物进行测序反应；五、测序反应产物进一步纯化；六、纯化产物利用遗传分析仪进行数据收集；或对核基因Chi1扩增的PCR产物，用遗传分析仪进行测序和数据收集；七、测序得到的原始序列峰图用软件打开，对测序质量高的个体读取碱基数据信息；原始序列比对和校正；鉴定出刺柏属近缘物种小子圆柏（JM）、方枝圆柏（JS）和西藏圆柏（JT）核基因Chi1的序列；八、分析和比对序列之间的差异程度，进行物种鉴定；具有鉴别快速和准确的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法
本专利技术属于分子生物
，具体涉及一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法。
技术介绍
物种的快速鉴定和识别是保护生物学和生物多样性研究的基础。然而，长期以来，人们对于植物物种的鉴定和识别主要依赖于物种间明显的外部形态特征，如植物的花、果实、种子、根、茎和叶等。同时，还依赖于专业分类人员的实践经验和指导。然而，在当前传统分类学专业人员急剧减少的情况下，基于物种外部形态特征的分类学鉴定方法，很难准确鉴定和识别物种间外部形态特征差异较小(尤其是物种间存在中间过渡形态性状的时候)的近缘植物物种类群。近年来，随着分子生物学技术的发展，尤其是DNA分子测序技术的飞速进步，DNA分子条形码(DNABarcoding)技术被提出用来快速鉴定物种。这一方法主要是通过对一段标准目的DNA分子序列片段进行比对分析从而对相关物种进行快速鉴定。作为一种新型的物种鉴定手段，DNA条形码技术自提出以来就被广泛应用到很多近缘类群的物种鉴定方面，如哺乳动物、鸟类、昆虫和鱼类等。在这些动物类群中，线粒体细胞色素C氧化酶(COI)基因序列有着丰富的和物种特有的变异位点，被认为可以作为动物物种鉴别的核心DNA分子条形码标记。然而，在植物类群中，由于线粒体基因较慢的进化速率，导致很难寻找到含有丰富变异的线粒体基因位点，这严重限制了线粒体基因标记在植物类群物种鉴定中的应用。鉴于此，国际生命条形码联盟(CBOL)和中国植物条形码研究团队(ChinaPlantBOLGroup)通过对大量植物类群的多个叶绿体DNA片段的反复筛选和实验研究，发现在被子植物中进化速率相对较快的叶绿体rbcL+matK基因标记组合以及核ITS基因片段有着丰富的变异位点，可以用来作为种子植物的核心DNA条形码分子标记。另外，叶绿体trnH-psbA基因片段可以作为辅助条形码标记，用于植物物种的DNA分子鉴定。然而，对于裸子植物类群来说，由于叶绿体基因较慢的突变速率，加上裸子植物本身较长的世代周期(从种子发育到植株个体成熟到再次产生种子，大约需要15年左右的时间)和大的有效种群大小(数量)导致了叶绿体DNA条形码rbcL+matK+trnH-psbA标记组合以及核ITS基因片段无法准确区分裸子植物近缘物种。这尤其表现在近期发生物种形成历史的柏科刺柏属物种上面，导致刺柏属物种间叶绿体DNA片段以及核ITS基因片段基因位点间的大量共享，使得使用这些标准DNA条形码分子标记组合很难准确鉴定和识别刺柏属近缘物种。本专利技术拟找到一段能够在刺柏属物种中具有丰富变异位点的核基因引物进行区分和鉴定刺柏属近缘物种。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，柏科刺柏属物种由于具有大量相同的外部形态特征和一些中间过度形态，一般都为常绿乔木或灌木树种；雌雄同株或异株；叶为刺叶或鳞叶，披针形或近条形；雄球花卵圆形或矩圆形，雌球花近圆球形；球果浆果状，近球形；种鳞合生，肉质；种子1-6粒，无翅，常有树脂槽，这导致了运用传统的形态分类学鉴定方法很难快速准确的鉴别这些物种，同时，由于刺柏属物种之间相对较近的物种形成和分化历史和大的有效种群数量，使得利用单亲遗传、进化速率较慢的叶绿体DNA分子标记很难鉴别这些物种。研究发现，柏科刺柏属物种在国际生命条形码联盟和中国植物条形码研究团队推荐使用的核心叶绿体DNArbcL+matK+trnH-psbA条形码标记组合和核ITS基因片段上均存在大量的基因多态性共享，导致无法准确区分刺柏属近缘物种。另外，以前的物种分子鉴定研究，大多一个物种取样一个个体进行鉴定，导致一个物种在不同地方进行取样时，由于近缘物种间的基因多态性共享或渐渗，可能使得亲缘关系较近的物种具有相同的基因序列或变异，这给物种的准确鉴别带来了极大困难，因此，本专利技术的目的是筛选出一种能够在刺柏属多个近缘物种中取样多个个体，利用具有双亲遗传特征、而且进化速率较快的核基因DNA分子条形码标记，进行物种的快速和准确鉴别的方法；利用具有双亲遗传特征、而且进化速率较快的核基因DNA分子条形码标记，进行物种的快速和准确鉴别。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，能够对刺柏属近缘物种进行快速和准确鉴别的DNA分子条形码标记，主要是利用一段双亲遗传的核基因Chi1引物对刺柏属近缘种不同个体的DNA样品进行扩增和序列测定，从而进行序列比对分析以及系统进化树的构建，进一步比较分析序列间的变异以及系统进化树上不同物种个体的聚类情况来进行物种的快速鉴定；具体包括以下步骤：一、对采集的刺柏属物种的干燥叶片或种子，使用CTAB法进行叶片总DNA或种子胚乳DNA的提取；具体程序如下：1)取自然干燥的刺柏属物种的一颗成熟种子，砸开外种皮；用蒸馏水侵泡种子10-24小时，用镊子分离种子中单倍体的胚乳，保存于4℃的冰箱内；2)研磨胚乳或粉碎叶片：对于分离的单倍体胚乳，放入事先预冷的研钵中，一颗种子的胚乳放到一起，加入适量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)粉末和液氮，迅速研磨成细粉末；对于干燥叶片，直接用电子天平称取0.02g，然后与不锈钢珠一同放进2.0mL的离心管中，并在离心管中加入适量PVP粉末，一同置于组织研磨器以30Hz频率打磨粉碎样品3min，使其尽可能成为粉末；3)粉末中加入800μL在65℃水浴中预热的2×CTAB溶液和8μL的β-巯基乙醇，轻弹让粉末完全混匀于2×CTAB溶液中，将离心管置于65℃水浴锅中水浴45min，期间每隔10min上下颠倒混匀；4)取出离心管，待温度降到室温，在12000rpm,4℃条件下离心10min；用剪掉头的蓝色枪头吸取上清液置于新的2.0mL离心管中，然后加入800μL氯仿-异戊醇溶液，上下颠倒混匀离心管10min，以进行杂质的抽提；5)在转速10000rpm、4℃条件下离心10min，转移上层液体到新的2.0mL离心管中，并加入800μL氯仿-异戊醇溶液，上下颠倒混匀离心管10min；6)在转速10000rpm，4℃条件下离心10min，用移液器吸取上清液(注意尽量不要吸取中间层的液体)置于1.5mL的新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇轻摇混匀，置于-20℃的冰箱中保存90min以上；7)取出后在4℃，转速12000rpm下离心10min，倒掉上层废液，再用70％乙醇漂洗沉淀2次，每次2-4min，然后放在超净工作台上自然风干；8)在离心管中加入60μL双蒸水溶解DNA沉淀，用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和产量，置于4℃的冰箱内保存备用；二、对检测合格的DNA样品，利用核基因Chi1引物进行PCR扩增和测序；具体PCR扩增体系为25μL：包括2.5μL10×PCRbuffer，0.5μL25mmol/LMgCl2，5μmol/L正反向核基因Chi1引物各1.2μL，0.5μL10mmol/LdNTP，0.25μL5U/μLr-TagDNA聚合酶，10～50ng的模板DNA，充分混匀后，在普通PCR扩增仪上进行PCR扩增反应；扩增程序为：先在94℃条件下预变性4分钟，接着进行36个循环，包括在94℃条件下变性45秒，55℃条件下退火45秒，72℃条件本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，其特征在于，包括以下步骤：一、对采集的刺柏属物种的干燥叶片或种子，使用CTAB法进行叶片总DNA或种子胚乳DNA的提取；具体程序如下：1)取自然干燥的刺柏属物种的一颗成熟种子，砸开外种皮；用蒸馏水侵泡种子10‑24小时，用镊子分离种子中单倍体的胚乳，保存于4℃的冰箱内；2)研磨胚乳或粉碎叶片：对于分离的单倍体胚乳，放入事先预冷的研钵中，一颗种子的胚乳放到一起，加入适量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)粉末和液氮，迅速研磨成细粉末；对于干燥叶片，直接用电子天平称取0.02g，然后与不锈钢珠一同放进2.0mL的离心管中，并在离心管中加入适量PVP粉末，一同置于组织研磨器以30Hz频率打磨粉碎样品3min，使其尽可能成为粉末；3)粉末中加入800μL在65℃水浴中预热的2×CTAB溶液和8μL的β‑巯基乙醇，轻弹让粉末完全混匀于2×CTAB溶液中，将离心管置于65℃水浴锅中水浴45min，期间每隔10min上下颠倒混匀；4)取出离心管，待温度降到室温，在12000rpm,4℃条件下离心10min；用剪掉头的蓝色枪头吸取上清液置于新的2.0mL离心管中，然后加入800μL氯仿‑异戊醇溶液，上下颠倒混匀离心管10min，以进行杂质的抽提；5)在转速10000rpm、4℃条件下离心10min，转移上层液体到新的2.0mL离心管中，并加入800μL氯仿‑异戊醇溶液，上下颠倒混匀离心管10min；6)在转速10000rpm，4℃条件下离心10min，用移液器吸取上清液置于1.5mL的新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇轻摇混匀，置于‑20℃的冰箱中保存90min以上；7)取出后在4℃，转速12000rpm下离心10min，倒掉上层废液，再用70％乙醇漂洗沉淀2次，每次2‑4min，然后放在超净工作台上自然风干；8)在离心管中加入60μL双蒸水溶解DNA沉淀，用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和产量，置于4℃的冰箱内保存备用；二、对检测合格的DNA样品，利用核基因Chi1引物进行PCR扩增和测序，具体PCR扩增体系为25μL：包括2.5μL10×PCR buffer，0.5μL25mmol/L MgCl2，5μmol/L正反向核基因Chi1引物各1.2μL，0.5μL10mmol/LdNTP，0.25μL5U/μLr‑Tag DNA聚合酶，10～50ng的模板DNA，充分混匀后，在普通PCR扩增仪上进行PCR扩增反应；扩增程序为：先在94℃条件下预变性4分钟，接着进行36个循环，包括在94℃条件下变性45秒，55℃条件下退火45秒，72℃条件下延伸2分30秒，最后72℃条件下终延伸10分钟，扩增产物保存在4℃的冰箱内，用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的纯度和产量；三、PCR扩增产物的纯化使用纯化试剂盒CASpure PCR Purification Kit对PCR扩增产物进行纯化：1)在solution Ⅱ中加入4倍体积的无水乙醇；2)从PCR反应管中将反应产物移至干净的1.5mL离心管中，加入5倍体积的solution Ⅰ混合均匀，得到混合液；3)将混合液转移到一个已经套入2.0mL离心管的吸附柱内，室温放置2min，在转速10000rpm时离心1min；4)重复步骤3)一次；5)倒掉2.0mL离心管中的废液，将吸附柱放入同一个2.0mL离心管中，于转速10000rpm的条件下空柱离心2min；6)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，于37℃时放置8‑12min以确保乙醇完全挥发干净；7)在吸附柱中吸附膜的中央加入30μL灭菌的双蒸水进行洗脱，双蒸水65℃预热，室温或37℃的水浴静置1min以上；8)转速10000rpm的条件下离心1min，此1.5mL离心管中的液体即为回收的DNA片段，用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测纯化产物的纯度和产量，于4℃条件下保存备用；四、对纯化产物进行测序反应纯化后的产物，用与PCR扩增时相同的引物进行测序反应，在普通PCR扩增仪上进行，10μL的反应体系包括：Big Dye Terminator(ABI)2.5μL，正向或反向核基因Chi1引物5pmol，纯化后的模板产物25‑50ng，测序反应的条件如下：首先95℃条件下预变性8秒，接着进行25个循环，包括95℃条件下变性15秒，50℃条件下退火15秒，60℃条件下延伸90秒，最后60℃条件下终延伸90秒，测序反应的产物保存在4℃的冰箱内；五、测序反应产物的进一步纯化测序反应的产物按如下步骤进行纯化：1)加入25μL的醋酸钠，避光室温放置30min，在25℃、转速4000rpm的条件下离心30min；2)离心结束后立即倒扣离心，转速不超过500rpm；3)加入35μL的75％乙醇，立即在25℃、转速4000...

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，其特征在于，包括以下步骤：一、对采集的刺柏属物种的干燥叶片或种子，使用CTAB法进行叶片总DNA或种子胚乳DNA的提取；具体程序如下：1)取自然干燥的刺柏属物种的一颗成熟种子，砸开外种皮；用蒸馏水侵泡种子10-24小时，用镊子分离种子中单倍体的胚乳，保存于4℃的冰箱内；2)研磨胚乳或粉碎叶片：对于分离的单倍体胚乳，放入事先预冷的研钵中，一颗种子的胚乳放到一起，加入适量的聚乙烯吡咯烷酮PVP粉末和液氮，迅速研磨成细粉末；对于干燥叶片，直接用电子天平称取0.02g，然后与不锈钢珠一同放进2.0mL的离心管中，并在离心管中加入适量PVP粉末，一同置于组织研磨器以30Hz频率打磨粉碎样品3min，使其尽可能成为粉末；3)粉末中加入800μL在65℃水浴中预热的2×CTAB溶液和8μL的β-巯基乙醇，轻弹让粉末完全混匀于2×CTAB溶液中，将离心管置于65℃水浴锅中水浴45min，期间每隔10min上下颠倒混匀；所述的2×CTAB溶液为十六烷基三甲基溴化铵溶液，其成分为：100mmol/LTris-HClPH8.0，1.4mol/LNaCl，20mmol/L乙二胺四乙酸二钠和2％CTAB；4)取出离心管，待温度降到室温，在12000rpm,4℃条件下离心10min；用剪掉头的蓝色枪头吸取上清液置于新的2.0mL离心管中，然后加入800μL氯仿-异戊醇溶液，上下颠倒混匀离心管10min，以进行杂质的抽提；5)在转速10000rpm、4℃条件下离心10min，转移上层液体到新的2.0mL离心管中，并加入800μL氯仿-异戊醇溶液，上下颠倒混匀离心管10min；6)在转速10000rpm，4℃条件下离心10min，用移液器吸取上清液置于1.5mL的新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇轻摇混匀，置于-20℃的冰箱中保存90min以上；7)取出后在4℃，转速12000rpm下离心10min，倒掉上层废液，再用70％乙醇漂洗沉淀2次，每次2-4min，然后放在超净工作台上自然风干；8)在离心管中加入60μL双蒸水溶解DNA沉淀，用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和产量，置于4℃的冰箱内保存备用；二、对检测合格的DNA样品，利用核基因Chi1引物进行PCR扩增和测序，具体PCR扩增体系为25μL：包括2.5μL10×PCRbuffer，0.5μL25mmol/LMgCl2，5μmol/L正反向核基因Chi1引物各1.2μL，0.5μL10mmol/LdNTP，0.25μL5U/μLr-TagDNA聚合酶，10～50ng的模板DNA，充分混匀后，在普通PCR扩增仪上进行PCR扩增反应；所述的核基因Chi1引物的序列为，正向：GGCGGCGGAGATTACTGTA，反向：TAGAAGACGCGCATTTGAGAA；扩增程序为：先在94℃条件下预变性4分钟，接着进行36个循环，包括在94℃条件下变性45秒，55℃条件下退火45秒，72℃条件下延伸2分30秒，最后72℃条件下终延伸10分钟，扩增产物保存在4℃的冰箱内，用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的纯度和产量；三、PCR扩增产物的纯化使用纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化：1)在solutionⅡ中加入4倍体积的无水乙醇；2)从PCR反应管中将反应产物移至干净的1.5mL离心管中，加入5倍体积的solutionⅠ混合均匀，得到混合液；3)将混合液转移到一个已经套入2.0mL离心管的吸附柱内，室温放置2min，在转速10000rpm时离心1min；4)重复步骤3)一次；5)倒掉2.0mL离心管中的废液，将吸附柱放入同一个2.0mL离心管中，于转速10000rpm的条件下空柱离心2min；6)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，于37℃时放置8-12min以确保乙醇完全挥发干净；7)在吸附柱中吸附膜的中央加入30μL灭菌的双蒸水进行洗脱，双蒸水65℃预热，室温或37℃的水浴静置1min以上；8)转速10000rpm的条件下离心1min，此1.5mL离心管中的液体即为回收的DNA片段，用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测纯化产物的纯度和产量，于4℃条件下保存备用；四、对纯化产物进行测序反应纯化后的产物，用与PCR扩增时相同的引物进行测序反应，在普通PCR扩增仪上进行，10μL的反应体系包括：ABICo.LtdBigDyeTerminator2.5μL，正向或反向核基因Chi1引物5pmol，纯化后的模板产物25-50ng，测序反应的条件如下：首先95℃条件下预变性8秒，接着进行25个循环，包括95℃条件下变性15秒，50℃条件下退火15秒，60℃条件下延伸90秒，最后60℃条件下终延伸90秒，测序反应的产物保存在4℃的冰箱内；五、测序反应产物的进一步纯化测序反应的产物按如下步骤进行纯化：1)加入25μL的醋酸钠，避光室温放置30min，在25℃、转速4000rpm的条件下离心30min；2)离心结束后立即倒扣离心，转速不超过500rpm；3)加入35μL的75％乙醇，立即在25℃、转速4000rpm的条件下离心15min；4)离心结束后立即倒扣离心，转速不超过500rpm；5)加入40μL的75％乙醇，立即在25℃、转速4000rpm的条件下离心15min；6)离心结束后立即倒扣离心，转速不超过500rpm；7)37℃的烘箱烘干半小时以上；8)取出后加入10μL甲酰胺；9)变性上机：95℃条件下变性5min，取出后快速放于冰上冷冻10min；10)纯化产物保存于4℃的冰箱内，待上机收集数据；六、纯化产物利用遗传分析仪进行数据收集；或者对于Chi1基因扩增的PCR产物，利用遗传分析仪进行测序和数据的收集；七、测序得到的原始序列峰图用Chromas软件打开，并对测序质量高的个体读取碱基数据信息；然后利用MEGAver.6.0软件进行序列比对和校正；鉴定出刺柏属近缘物种小子圆柏JM、方枝圆柏JS和西藏圆柏JTChi1基因的序列：小子圆柏#292-1-JMCAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGTTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGACGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGACTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA小子圆柏#292-2-JMCAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGTTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGACGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGACTTGAATGCGGGAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：李忠虎，房敏峰，岳明，刘文哲，刘占林，赵鹏，赵桂仿，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61