本发明专利技术涉及鉴定样品中的PUFA-PKS的筛选方法。本发明专利技术涉及快速简单地鉴定微生物中的PUFA PKS的方法。所述方法的特征在于，代表PKS的特异性生产PUFA（多不饱和脂肪酸）的DNA片段可在体外再现。PUFA PKS特异的氨基酸序列LGIDSIKRVEIL使之衍生寡核苷酸成为可能，所述寡核苷酸通过PCR有效筛选PUFA PKS基因或产生PUFA的微生物。本发明专利技术方法尤其适用于高通量筛选微生物的PUFA PKS基因。
【技术实现步骤摘要】
鉴定样品中的PUFA-PKS的筛选方法 本申请是申请日为2005年4月8日、中国国家申请号为200580018877. 2、专利技术名 称为鉴定样品中的PUFA-PKS的筛选方法申请的分案申请。 本专利技术描述了一种快速和简单鉴定在样品，例如，生物样品中，特别是在微生物中 的PUFA-PKS基因（PUFA=多不饱和脂肪酸；PKS=多酮化合物合酶）的方法。其特征是对于 产生PUFA的PKS特异性的DNA片段的体外复制。除了鉴定适当的DNA序列之外，本专利技术还 基于扩增它们的实验条件的确立。 术语PUFAs (多不饱和脂肪酸）表示具有链长度〉C12和至少两个双键的多重不 饱和长链脂肪酸。有两个PUFA的主要家族，其根据相对于烷基末端，第一个双键在ω-3 和在ω-6脂肪酸中的位置而区别。它们是细胞膜的重要组分，在那里它们以脂质，特别是 磷脂的形式存在。I 3UFAs还作为在人和在动物中的重要分子，例如，前列腺素，白三烯和环 前列腺的初级阶段而起作用（Α.Ρ. Simopoulos, essential fatty acids in health and chronic disease, Am. J. Clin. Nutr. 1999 (70)，pp. 560-569)。ω-3 脂肪酸族的重要代表是 DHA(二十二碳六烯酸）和ΕΡΑ(二十碳五烯酸），其可以在鱼油和在海洋微生物中发现。 ω-6脂肪酸的重要代表是ARA(花生四烯酸），其出现在，例如，丝状真菌中，但是也可以从 动物组织如肝和肾中分离。DHA和ARA在人母乳中彼此相接出现。 PUFAs对于人来说在适当发育方面，特别是对于发育脑，组织形成及其修复是必需 的。因而，DHA是人细胞膜的重要组分，特别是神经的细胞膜。另外，DHA在脑功能的成熟中 发育重要作用并且对于视力的发育是必需的。《-3PUFAs如DHA和EPA被用作营养添加剂， 因为具有DHA充分供应的平衡营养对于某些疾病的预防有利（A. Ρ. Simopoulos，Essential fatty acids in health and chronic disease, American Journal of Clinical Nutritionl999 (70)，pp. 560-569)。例如，患有非胰岛素依赖型糖尿病的成人呈现与后来 出现的心脏问题相关的DHA平衡的缺陷或者至少是失衡的DHA平衡。同样地，神经元疾病 如，例如，阿尔茨海默病或精神分裂症伴随着低的DHA水平。有大量的DHA商业提取物的 来源，例如，来自海洋冷水鱼的油，蛋黄部分或海洋微生物。适于提取n-3PUFA的微生物发 现于，例如，弧菌属（Vibrio)的细菌中（例如，海产弧菌（Vibrio marinus))或腰鞭毛虫 (Dinophyta)中，其中特别是 Crypthecodinium 属，如 C.cohnii 或在 Stramenopiles (或 Labyrinthulomycota)中,如 Pinguiophyceae 例如，Glossomastix, Phaeomonas, Pingu iochrysis, Pinguiococcus 和 Polypodochrysis。其它生产 PUFA 的优选微生物特别属 于 Thraustochytriales 目,(Thraustchytriidea)Japonochytrium M , Schizochytrium 属，Thraustochytrium 属，Althornia 属，Labyrinthuloides 属，Aplanochytrium 属和 Ulkenia 属。被抱霉属（Mortierell), Entomophthora 属，Phytium 属和 Porphyridium 属的 微生物被用于ARA的商业生产。 商业上使用的PUFA的来源如植物或动物的特征经常是提取自它们的油的组成非 常不均匀。以这种方式提取的油必须进行昂贵的纯化处理以便能够富集一种或几种PUFAs。 来自这些来源的PUFA的供应也会发生不可控制的波动。因而，疾病和天气影响可减少动 物也可减少植物的产量。从鱼中提取PUFA出现季节波动并且甚至可以由于过度捕捞或气 候变化(例如，厄尔尼诺现象）而暂时性地急剧受限。动物油，特别是鱼油，可以通过食物 链从环境中积聚有害物质。已知动物受有机氯化物如，例如，多氯化联苯高度胁迫，特别是 在商业性鱼场中，其抵消了鱼类消费的健康方面（Hites等，2004，Global assessment of organic contaminants in farmed salmon, Science303，pp. 226-229)。鱼产品质量的所得 损失导致消费者对于鱼和鱼油作为ω-3 PUFA来源的接受度下降。另外，从鱼纯化DHA因 为高度技术需要而相对昂贵。另一方面，DHA存在于少数海洋微生物，占细胞总脂肪组分的 大约50%，并且它们可在大的发酵罐中进行相对经济地培养。微生物的另一个优点是提取 自它们的油组合物限于一些组分。 对于长链PUFA的生物合成已知两种不同的生物代谢途径。对于所谓的Sprecher 途径来说，通过延长和去饱和步骤以及停止缩短的流程由棕榈酸起始来合成长链PUFAs如 DHA 和 EPA(Η. Sprecher, Metabolism of highly unsaturated n_3and n-6fatty acids. Biochimica et Biophysica Actal486(2000)pp. 219-231)。在大多数生物中如所述或以相 似的方式采用这种生物合成途径，甚至在人和植物中。不过，某些海洋生物采取不同的生物 合成途径进行EPA和DHA的生产。这些生产PUFA的微生物包括γ蛋白细菌的海洋代表和 到目前为止的真核原生生物Schizochytrium。它们通过所谓的多酮化合物合酶（PKS)来合 成长链PUFA。这些PKSs代表催化由酮化合物（ketide)单位组成的次级代谢产物合成的大 SI (G. ff. Wallis, J. L. Watts and J. Browse, Polyunsaturated fatty acid synthesis:what will they think of next?Trends in Biochemical Sciences27(9)(2000)pp. 467-473)〇 多酮化合物的合成包含许多与脂肪酸合成类似的酶反应（Hopwood&Sherman Annu. Rev.Genet. 24(1990)pp· 37-66 ;Katz&Donadi〇 Annu. Rev. of Microbiol. 47 (1993) pp.875-912)。 已知不同PUFA-PKSs (PUFA-合成性PKSs)的基因序列。由此，从海洋细菌 Shewanella sp.中分离出38kb的基因组片段，其包含生产二十碳五烯酸（EPA)的信息。 有可能通过包含在基因组片段中的基因簇的转移而在大肠杆菌（E. coli)和Synechoccus 中生产EPA。随后对这一片段的测序导致鉴定了 8本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鉴定样品中PUFA‑PKS基因特异性核酸序列的方法，其中(a)利用特异性寡核苷酸并以小部分的样品作为模板进行聚合酶链式反应(PCR),和(b)对获得的PCR产物进行测序并将获得的序列信息与数据库相比较以便通过与已知序列的部分一致来鉴定新的PUFA‑PKS序列信息，其特征是所用的寡核苷酸源自氨基酸序列LGIDSIKRVEIL。
【技术特征摘要】
2004.04.08 DE 102004017369.91. 一种鉴定样品中PUFA-PKS基因特异性核酸序列的方法，其中 (a) 利用特异性寡核苷酸并以小部分的样品作为模板进行聚合酶链式反应（PCR)，和 (b) 对获得的PCR产物进行测序并将获得的序列信息与数据库相比较以便通过与已知 序列的部分一致来鉴定新的PUFA-PKS序列信息， 其特征是所用的寡核苷酸源自氨基酸序列LGIDSIKRVEIL。2. 根据权利要求1的方法，其特征是所述寡核苷酸是简并性的。3. 根据任一项在前权利要求的方法，其特征是所述寡核苷酸的长度为10_36bp，优选 15-25bp并且特别优选18bp。4. 根据任一项在前权利要求的方法，其特征是所用寡核苷酸的量优选为大约20pm...
【专利技术属性】
技术研发人员：马尔库什·卢伊，马西亚斯·鲁辛，
申请(专利权)人：努特诺瓦营养产品及食品成分有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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