一种检测口蹄疫O型病毒的试剂盒及制备方法技术

本发明专利技术公开一种可用于检测口蹄疫O型病毒的引物，以及用这些引物制备的检测试剂盒和制备方法。本发明专利技术的用于检测口蹄疫O型病毒的引物基因序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4。相关实验表明，采用本发明专利技术的引物序列可特异性快速扩增口蹄疫O型病毒的核酸，通过核酸电泳检测到特异性条带，并具有特异性。本发明专利技术能够对口蹄疫病毒进行高通量的定性、定型和定量检测。相比于其他已存在的方法和试剂盒，本发明专利技术在用于港口检疫、动物流通环节检疫以及实验室诊断均很大的优势。

【技术实现步骤摘要】
一种检测口蹄疫O型病毒的试剂盒及制备方法
本专利技术涉及一种可用于检测口蹄疫O型病毒的引物及检测试剂盒和制备方法。
技术介绍
口蹄疫（Foot-and-mouthdisease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV）引起的动物急性、烈性传染病，主要危害猪、牛、羊痘偶蹄动物，发病率极高，造成了巨大的政治、经济损失，因此被世界卫生组织（OIE）列为A类传染病的首位。FMDV可以分为7个血清型，即A型、O型、C型、Asia1型、SAT1型、SAT2型和SAT3型，每个血清又有许多不同的亚型，且各血清型之间没有交叉性免疫，同一血清型的各亚型之间仅有部分交叉免疫。口蹄疫病毒的分型鉴别诊断一直是研究的热点。由于口蹄疫各血清型之间没有交叉保护，同一血清型的各亚型之间仅有部分交叉免疫，这使得口蹄疫的诊断和控制更加困难。补体结合试验曾被用于口蹄疫诊断和病毒分型，直到1970s该方法仍在一些流行病地区使用，但是该方法的灵敏度比较低。Roeder和LeBlancSmith通过使用兔和豚鼠抗纯化146S口蹄疫病毒颗粒高滴度抗血清的ELISA方法成功地检测了口蹄疫病毒抗原。该方法的灵敏度比补体结合试验高125倍，并且被用作常规口蹄疫的诊断和病毒分型。但是ELISA方法检测含病毒的上皮悬浮液只有约70-80％阳性结果，因此病毒必须在组织培养中进行增殖后，再通过ELISA中进行检测和血清型分型。基于单抗的ELISA也被开发用于口蹄疫的诊断和病毒分型(Chen,H,etal.,2012;MoriokaK,etal.,2009)。最近，有人研发了基础整联蛋白ανβ6和血清特异性单克隆抗体的夹心ELISA方法，并将该方法与普通的多克隆抗体夹心ELISA方法进行了比较。整合蛋白/单克隆抗体的ELISA可以识别FMDV的多种抗原和不同的血清型，虽然该方法在同一灵敏度的条件下比常规的多克隆ELISA具有更高的特异性，但是仍然有一些FMDVs不能被检测出来，(FerrisNP,etal.,2011)。由于RT-PCR快速，灵敏和可靠性的优点，该方法已被广泛地用于口蹄疫诊断。近年来各种RT-PCR检测方法已用于早期上皮细胞，细胞培养分离和其组织中口蹄疫病毒RNA的检测(MeyerRF,etal.,1991)。Rodriguez等首次可通过RT-PCR对口蹄疫病毒O型、A型和C型进行分型检测(RodríguezA,etal.,1992)。自此以后不同血清型特异性引物RT-PCR方法已被用于口蹄疫病毒7个血清型份分型检测(Callens,etal.,1997;Vangrysperre,etal.,1996)。这些检测引物位于口蹄疫病毒基因组的不同位置，包括5'非编码区、开放阅读框和3'端非编码区。为了提高RT-PCR诊断灵敏度，多组引物结合的多重检测也被用于口蹄疫的检测(GiridharanP,etal.,2005;BaoH,etal.,2008)，但是这些RT-PCR方法的灵敏度依然有限，若前期再结合ELISA方法一起使用必然会使该过程更加耗时费力。最近，实时荧光定量RT-PCR方法已被用于口蹄疫病毒的检测，该方法不需要PCR后期处理（例如凝胶分析）且通过应信号来直接监视目标cDNA的扩增。TaqMan实验的检测效果同抗原结合ELISA的病毒分离实验一样(ReidSM,etal.,2003)。目前，两种不同的实时荧光定量RT-PCRTaqMan实验已普遍使用，一种针对5'非编码区的内部核糖体进入位点（IRES）(ReidSM,etal.,2002)和第二种针对3D（RNA聚合酶）的编码序列。实时荧光定量RT-PCR方法的速度和准确性可以从样品核酸提取到实验建立的计算机操作的偶联进一步提高。这使得该检测适合于主要指示病例诊断和在持续疫情中的检测。实时/定量RT-PCR试验目前在许多发达国家作为一种口蹄疫病毒诊断和定量的常规测试。但是，这些实验不是专门设计用于的区分口蹄疫病毒血清型。已经证明5'端非编码区检测在A血清型病毒的检测中更敏感，而在3D检测试验对检测SAT病毒具有更高的灵敏度(KingDP,etal.,2006)。另外，由于探针靶向区域的核苷酸错配，这些检测方法不能检测少量的FMDVs。因此，任何一种单独的检测方法不能100％的检测FMDV。最近，Tam等报道了用于口蹄疫病毒检测和病毒分型荧光多重rRT-PCR检测方法，该方法具有更高的检测灵敏度，但却不能区分某些血清型之间的交叉反应性(TamS,etal.,2009)。rRT-PCR便携式设备使得FMDV野外样品的检测成为可能，然而这种设备比较昂贵、比较脆弱且精密度要求比较高。因此，其他的方法，如环介导扩增的方法被用来进行野外样品的检测。LAMP在一个恒定的温度扩增特异性核苷酸序列，因此不需要热循环仪。该方法基于DNA序列通过一自动循环链置换反应扩增的原理，使用一组两个特别设计的内引物和两个外引物和具有链置换高活性的DNA聚合酶进行该测定法etal.,2000)。引物在初始阶段识别6个独立的靶序列和在LAMP反应的后期阶段识别4个独立的序列，使用标准的水浴或加热块进行该反应少于一个小时，然后对结果用肉眼进行可视化观察。其优点为其简单操作，反应快速且结果直观，这使得该方法已被许多疾病流行国家进行野外样品检测。已有口蹄疫病毒高通量的RT-LAMP的建立，然而该方法由于容易污染造成假阳性，就尚未得广范的认可(DukesJP,etal.,2006)。ELISA和RT-PCR结合的口蹄疫检测方法具有很高的可靠性和准确性，但样品从采样点到实验室的运输问题成为口蹄疫病毒早期诊断的最大障碍。因此，在疑似疫情点急需一种可以用于疾病快速诊断和特异性检测的方法。由Reid等人建立一种基于单克隆抗体的口蹄疫层析试纸条技术(ReidSM,etal.,2001)。该试纸条检测上皮悬浮液测试中的口蹄疫病毒抗原灵敏性与常规抗原ELISA灵敏性一样，且对口蹄疫病毒血清型O、A、C和Asia1在细胞培养上清有着100％等效的敏感性，但是却不能够对这些血清型进行区分。因此，急需一种灵敏度高的能够特异性区分不同FMDV型别的高通量的检测方法。研究表明，口蹄疫病毒的A、O、Asia1三种血清型的RNA序列同源性约为70%左右，然而其编码结构蛋白的P1区域的差异比较好，该区域的核苷酸序列也常常被用来进行口蹄疫病毒的分型及进化分析。在病毒的这些基因中，VP1蛋白参与病毒的吸附、入侵、免疫反应，并且与病毒的血清型特异性有关。因此VP1的基因序列通常被用来进行FMDV不同毒株之间的亲缘关系分析，从而研究口蹄疫的分子流行病学规律。准确鉴定分离株种属和弄清其来源将有助于口蹄疫的流行病学分析,具有重要意义。根据口蹄疫病毒VP1基因组序列构建进化树分析发现，A型有10个亚型（Ⅰ-Ⅹ）；O型也有10个亚型，即欧洲-南美洲型（Euro-SA）、中东-南非型（ME-SA）、东南亚型（SEA）、中国型（CHY）、西非型（WA）、东非1型（EA-1）、东非2型（EA-2）、东非3型（EA-3）、印尼1型（ISA-1）和印尼2型（ISA-2）；Asia1有6个亚型（Ⅰ-Ⅵ）。此外，VP1基因也常被本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测口蹄疫O型病毒的引物，其特征在于引物基因序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、和SEQ ID No.4。

【技术特征摘要】
1.用于非疾病诊断目的特异性检测口蹄疫O型病毒的方法，其特征在于以被检样品的RNA为模板，用SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、和SEQIDNo.4引物进行扩增，扩增产物进行毛细管电泳分析，根据毛细管电泳信号分析图中286bp处是否出现峰值，且信号大于2000...

【专利技术属性】
技术研发人员：张强，卢昌，赵志荀，吴国华，颜新敏，李应国，岳华，周晓黎，李健，朱海霞，代雪玲，田波，芦晓立，高顺平，王曼，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62