本发明专利技术公开了一种特异性克伦特罗半抗原衍生物、克伦特罗人工抗原及其制备方法和应用。根据克伦特罗的结构进行定向合成的特异性克伦特罗半抗原衍生物结构式为，该衍生物结构在克伦特罗的三个甲基一端引入一个羧基活性官能团结构，最大限度的暴露了克伦特罗的特异性的苯环附属结构，同时具有可以与载体蛋白偶联的官能团。一种克伦特罗人工抗原，是将克伦特罗半抗原衍生物与载体蛋白偶联的到得偶联物，其中所述载体蛋白protein为牛血清蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）；根据人工抗原免疫动物得到高特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，人工抗原和制备得到的高特异性单克隆抗体，可应用于胶体金法或荧光免疫层析法检测克伦特罗。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种特异性克伦特罗半抗原衍生物、克伦特罗人工抗原及其制备方法和应用。根据克伦特罗的结构进行定向合成的特异性克伦特罗半抗原衍生物结构式为，该衍生物结构在克伦特罗的三个甲基一端引入一个羧基活性官能团结构，最大限度的暴露了克伦特罗的特异性的苯环附属结构，同时具有可以与载体蛋白偶联的官能团。一种克伦特罗人工抗原，是将克伦特罗半抗原衍生物与载体蛋白偶联的到得偶联物，其中所述载体蛋白protein为牛血清蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）；根据人工抗原免疫动物得到高特异性的单克隆抗体和多克隆抗体，人工抗原和制备得到的高特异性单克隆抗体，可应用于胶体金法或荧光免疫层析法检测克伦特罗。【专利说明】一种特异性克伦特罗半抗原衍生物、克伦特罗人工抗原及 其制备方法和应用
本专利技术涉及生物化工生物检测
，具体地，涉及一种克伦特罗半抗原和人 工抗原合成方法以及在检测克伦特罗中的应用。
技术介绍
随着社会的发展和进步，人们生活水平不断地提高，对健康饮食越来越重视。食品 安全问题，特别是食品中的兽药残留问题越来越引起人们的高度重视。要提高禽畜产品的 安全，除了严格控制和有效的管理之外，对添加剂以及兽药等有毒化学物质残留的监控是 至关重要的，因此，科学准确的兽药残留检测方法是动物源食品安全与否的重要保障。 克伦特罗（Clenbuterol，Clen)是一种人工合成的β 2_肾上腺素受体激动剂，常作 为支气管扩张剂用于防治支气管哮喘、哮喘性慢性支气管炎症及肺气肿等呼吸系统疾病所 致的支气管痉挛。当其用量达到治疗量5~10倍时，Clen可增强肌肉发育，降低脂肪沉积，因 此又称瘦肉精。所以Clen常被作为饲料添加剂非法用于肉用动物的生产之中。更重要的 是，由于Clen在动物体内吸收快，分布广，脂溶性高，具有残留性积累和半衰期长等特性。 人在食用残留有Clen的肉品后引起的中毒事件不断发生。因此，各国政府度禁止Clen作 为饲料添加剂用于肉用动物的生产之中。我国政府也规定严禁在饲料中添加 Clen，并制订 了 Clen残留量标准。所以加强对该类药物在食品中的残留检测和监督非常必要。 目前，国家标准和行业标准中对饲料及动物源性食品中克伦特罗残留的检测常采 用HPLC和GC - MS法。虽然此方法特异性强、灵敏度高、精确，但是样本前处理操作步骤繁 琐，成本高，再加上设备昂贵、花费大、操作技能要求高等原因而不适合大批量样品的筛选 检测。免疫分析法(如酶联免疫法、胶体金法以及荧光免疫层析发)，由于在抗原抗体的定性 定量方面独特的优势和操作简便分析样本大等优点弥补了理化分析的不足，在β -兴奋剂 的残留检测中起着越来越重要的作用。酶联免疫吸附测定法可同时检测多个样品，具有灵 敏、特异性强等优点，但是不适用于现场检测。胶体金法和荧光免疫层析法操作简单、快速、 无需大型检测仪器设备，更适用于现场及时检测，是快速检测发展的趋势。 影响免疫分析法检测质量的根本原因是抗体的特异性与亲和性，这些性质又取决 于免疫半抗原的分子结构，所以免疫半抗原分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分 子药物残留快速检测技术研究最基础和最关键的步骤。 CN103159852A(2013-6-19)公开了一种特异性克伦特罗人工抗原的合成方法，然 而该方法中所用的免疫半抗原的分子结构和人工抗原制备仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种特异性克伦特罗半抗原衍生物。 本专利技术的目的之二是提供一种特异性克伦特罗半抗原衍生物的制备方法。 本专利技术的目的之三是提供一种特异性克伦特罗抗原。 本专利技术的目的之四是提供一种特异性克伦特罗抗原的制备方法。 本专利技术的目的之五是提供所述克伦特罗半抗原和人工抗原在克伦特罗免疫检测 中的应用。 本专利技术提供了一种特异性克伦特罗半抗原衍生化合物，其化学结构式为： 【权利要求】1. 一种特异性克伦特罗半抗原衍生物，其特征在于所述衍生物适用于制备克伦特罗人 工抗原，其化学结构式为：2. -种制备如权利要求1所述特异性克伦特罗半抗原衍生物的方法，其特征在于，以 化合物4-氨基-3, 5-二氯溴代苯乙酮为原料，通过两步反应制备，其制备路径如下：3. -种制备如权利要求2所述特异性克伦特罗半抗原衍生物的方法，其特征在于， 所述反应条件具体为在〇. 015-0. 028mol的4-氨基-3, 5-二氯溴代苯乙酮固体中加入异 丙醇作为溶剂，在冰水浴条件下加入〇. 01-0. 〇3mol的4-氨基-4甲基-戊酸，常温反应 0. 8-1. 2h，待原料完全转化后进行结晶、过滤、洗涤干燥得到第一白色固体； 将所述第一白色固体溶于乙醇中，依次加入〇· 001-0. 〇〇3mol 92-98%%的KBH4 0. 002-0. 003mol ZnCl2，常温反应12-18h后，过滤；滤液浓缩，异丙醇洗涤，得到第二白色固 体即为特异性克伦特罗半抗原衍生物。4. 一种由权利要求1所述特异性克伦特罗半抗原衍生物制备得到的特异性克伦特罗 人工抗原，其特征在于其化学结构式为：所述protein即载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。5. -种制备如权利要求4所述特异性克伦特罗人工抗原的方法，其特征在于利用碳二 亚胺法将所述特异性克伦特罗半抗原衍生物化合物与载体蛋白偶联得到，包括以下步骤： P1、将所述克伦特罗半抗原衍生化合物溶解于DMS0或DMF中得到衍生化合物溶液； P2、向P1中加入EDC( 1- (3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)再加入NHS (N-羟 基琥珀酰亚胺）室温、搅拌下均匀混合后反应15飞0分钟；所述EDC、NHS和克伦特罗半抗原 衍生化合物摩尔用量比为广2:广1.5:广2 ; P3、将P2中所得到的反应液在25~30度下加入到含有载体蛋白的溶液中搅拌，进行偶 联反应1飞小时，其中所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白； 所述载体蛋白为牛血清白蛋白时，衍生化合物与牛血清白蛋白的摩尔比为4(T60:1，且 合成的人工抗原为克伦特罗免疫原；载体蛋白为卵清蛋白时，衍生化合物与卵清蛋白的摩 尔比为3(Γ50:1，且合成的人工抗原为包被原； Ρ4、将Ρ3所述反应液进行透析，收集透析液即为克伦特罗人工抗原。6. 根据权利要求5所述特异性克伦特罗人工抗原的制备方法，其特征在于，Ρ3中所述 载体蛋白溶液的缓冲液为〇· lmol/L的NaHC03缓冲液；Ρ4中所述透析液为0· Olmol/L、ΡΗ 为7. 2~7. 9的磷酸缓冲液。7. 根据权利要求4所述特异性克伦特罗人工抗原，其特征在于，可用于制备克伦特罗 抗体，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。8. 根据权利要求4所述特异性克伦特罗人工抗原的应用，其特征在于，可用于胶体金 法或荧光免疫层析法检测克伦特罗中。9. 根据权利要求8所述特异性克伦特罗人工抗原的应用，其特征在于，所述克伦特罗 人工抗原在荧光免疫层析法检测克伦特罗中的应用，其步骤如下： P1.利用所述克伦特罗人工抗原免疫动物制备抗体； P2.细胞融合和筛选； P3.腹水制备和抗体纯化； P4.将P3中得到的抗体和抗兔IgG二抗分别进行荧光本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种特异性克伦特罗半抗原衍生物，其特征在于所述衍生物适用于制备克伦特罗人工抗原，其化学结构式为：。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨志行，叶渭龙，郭彦飞，文明，黄昌妹，朱冰美，张乐，
申请(专利权)人：湖州海创生物科技有限公司，中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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