精液的检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种精液的检测方法、试剂盒及其应用。所述方法或试剂盒能够减少精液样品的用量，方便检测出精浆的氧化应激水平，又能检测其中的白细胞污染程度和精子的氧化应激能力，提高检出率。

【技术实现步骤摘要】
精液的检测方法及其试剂盒
涉及一种生物样品的检测方法和检测试剂盒，尤其涉及人体精液样品的检验方法和检验试剂盒。
技术介绍
正常精液是一种混合物，在射精时由睾丸和附睾的分泌液及悬浮其中的精子与前列腺、精囊腺和尿道球腺的分泌物混合而成。最终射出的混合物是一种粘稠的液体，即射出的精液以团块状连续数次射出，通过输精管切除术前后的比较显示，就体积而言有90%是自附属腺体的分泌物，其中主要是前列腺和精囊腺，少部分来自尿道球腺和附睾。精液的两个主要量化指标:1.精子总数，反应睾丸的生精状况和睾丸后管道系统的通畅程度；2.体积，反应腺体的分泌能力。精子功能主要受精子自身的活力、运动、形态和精浆成份的影响。在固定条件下，精液样本质量主要受睾丸生精功能、附属腺体的分泌、近期患病情况尤其高热性疾病，以及其它如禁欲时间的长短的影响。精液中常含有一定的非精子细胞成分，部分与临床关系密切，通常包括泌尿生殖道上皮细胞、前列腺细胞、生精细胞和白细胞，后两种统称为“圆细胞”。这些细胞成分在染色后的涂片中(放大1000倍)难以区别，但可以通过过氧化物过氧化物酶技术和全白细胞单克隆抗原技术来进行鉴别。目前有相当证据表明，少量白细胞在调节自身免疫应答中起着重要作用，但在病理情况下，也即男性或女性生殖道中过量存在的白细胞极其代谢产物，则会影响男性精子的功能，降低精子活力和授精能力。一般认为，精液中的白细胞主要通过释放活性氧(Reactive Oxygen Species,R0S)导致精子细胞膜脂质过氧化途径而损伤精子功能。由于精液中存在复杂的氧化及抗氧化系统，单纯通过形态学检测精液白细胞数量有一定的局限性，因此评价精液活性氧水平，特别是精液中白细胞的氧化应激水平的方法将是传统检测方法的极好补充。检测精浆中活性氧水平和通过自由基生成能力来快速检测精液中是否存在白细胞污染，并可评估精子的氧化应激能力，反映精子生成过程的整体质量，在研究分析男性不育的病因以及治疗中有着重要的意义，并可应用与男性不育干预治疗效果的评估。样本的采集和检查都按照规范化程序进行，其结果才有价值。本章所述操作流程被认定为进行精液评估的基本组成步骤。
技术实现思路
本申请的主要涉及一种检验精液氧化应激的方法或试剂盒。在一些实施方案中，提供一种检验精液氧化应激的方法，所述方法包括，向20 μ 1-200 μ I精液样品中加入10 μ 1-100 μ I鲁米诺溶液和10 μ 1-100 μ I的过氧化物酶溶液，反应后得到混合物Α，记录混合物A的分光光度值Dr ；向混合物A中加入10 μ 1-100 μ I fMLP溶液，反应后得到混合物B，记录混合物B的分光光度值Df ；以及向混合物B中加入10 μ 1-100 μ I PMA溶液，反应后得到混合物C，记录混合物C的分光光度值Dp ；根据Df/Db比值的对数值确定此精液是否为白细胞精子症，和/或根据Dp/Dr比值的对数值确定精子的氧化应激值是否正常。在一些实施方案中，提供一种检验精液氧化应激的试剂盒，所述试剂盒包括，鲁米诺溶液；过氧化物酶溶液；fMLP 溶液；PMA溶液；以及任选地，所述试剂盒还包括阳性对照品(例如，0.02% H2O2,硼酸钠溶液)和/或阴性对照品(例如，PBS)。在一些实施方案中，所述方法或试剂盒中使用的鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、fMLP溶液、PMA溶液的工作浓度为:鲁米诺溶液(2.5mM)；过氧化物酶溶液(12.5IU/ml)；fMLP 溶液(0.2mM)；以及PMA 溶液(0.4 μ M)。在一些实施方案中，所述试剂盒能够提供单次使用的单份的10 μ 1-100 μ I鲁米诺溶液、10 μ 1-100 μ I的过氧化物酶溶液、10 μ 1-100 μ I FMLP溶液以及10 μ 1-100 μ I PMA溶液等检测试剂。因此，所述试剂盒包含至少一份这样的检测试剂。在一些实施方案中，本申请公开的试剂盒还包含标准品，其通过所包含的检测试齐U，尤其是单份检测试剂检测后，能够绘制出ROS的标准曲线。在另一些实施方案中，所述试剂盒包含述阴性标准品和/或阳性标准品。在一些实施方案中，所述阳性标准品为白细胞污染对照品。Df/Db比值的对数值> 1.25，说明所述精液样品中为白细胞精子症。在一些实施方案中，所述试剂盒是用来实施本申请所公开的方法的试剂盒。在一些实施方案中，所述Dr/Db比值的对数值来判断精液样品中精浆的氧化应激值是否处于正常范围。通常为，Dr/Db比值的对数值< 0.75，说明所述精液样品中精浆的氧化应激能力正常。在一些实施方案中，所述Df/Dbr比值的对数值来判断精液样品中是否存在白细胞污染。通常为，Df/Db比值的对数值> 1.25说明所述精液样品中存在白细胞污染。在一些实施方案中，所述Dp/Dr比值的对数值大于等于0.9，说明所述精液样品中的精子氧化应激能力正常。通常为，Dp/Dr比值的对数值大于等于0.9说明所述精液样品中精子氧化应激能力正常。在一些实施方案中，所述精液样本的检测用量与现有技术比较，明显减少，例如，200μ 1、150μ 1、100μ 1、75μ 1、50μ I或30μ I。由于本申请公开的方法或其试剂盒使用的精液样品用量减少，所以能够利用有限的精液样品进行重复试验或其它项目的分析。在一些实施方案中，本申请公开的方法和试剂盒能够同时分析精液中的白细胞污染和精子的氧化应激能力，即精子的活力，从而能够在一次检查中鉴别出不育症是由于白细胞污染还是精子活力降低而引起的，或者二者均存在。因此，本申请所公开的精液氧化应激的检测方法及其试剂盒为快速检测精液中是否存在白细胞污染、精浆和精子的氧化应激能力提供了一种新的评估方法和手段。附图简要说明图1A和图1B分别显示白细胞含量与化学发光值的对数线性关系。图1A为fMLP刺激下，白细胞含量与化学发光值的对数线性关系；图1B为PMA刺激下，白细胞含量与化学发光值的对数线性关系。图2A和图2B分别显示使用鲁米诺_过氧化物酶系统观察到的精液的化学发光图形。图2A显示在存在白细胞污染的情况下，加入白细胞特异探针fMLP后，产生一个ROS峰。图2B显示如果没有白细胞污染，fMLP反应的ROS峰则消失，而由PMA引发一个显著的由精子产生的化学发光信号。【具体实施方式】一方面，本申请涉及一种检验单份精液氧化应激的方法。另一方面，本申请涉及一种检验单份精液氧化应激的试剂盒。在一些实施方案中，提供一种检验单份精液氧化应激的方法，所述方法包括，取计数后的20μ 1-200μ I精液样品于样品管内，记录样品的发光值数据I为Db ;向20 μ 1-200 μ I精液样品中加入10 μ 1-100 μ I鲁米诺溶液(2.5mM)和10 μ 1-100 μ I的过氧化物酶溶液(12.5IU/ml)，反应后得到混合物A，记录混合物A的发光值Dr ；向混合物A中加入10 μ 1-100 μ I fMLP溶液(0.2mM)，反应后得到混合物B，记录混合物B的发光值Df ;以及向混合物B中加入10 μ 1-100 μ I PMA溶液(0.4 μ Μ)，反应后得到混合物C，记录混合物C的发光值Dp ；Dr/Db比值的对数值来确定此精液中的精浆氧化应本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检验个体精液氧化应激的试剂盒，所述试剂盒包括，鲁米诺溶液；过氧化物酶溶液；FMLP溶液；PMA溶液；以及任选地，阳性对照品和/或阴性对照品。

【技术特征摘要】
1.一种检验个体精液氧化应激的试剂盒，所述试剂盒包括， 鲁米诺溶液； 过氧化物酶溶液； FMLP溶液； PMA溶液；以及 任选地，阳性对照品和/或阴性对照品。2.如权利要求1所述试剂盒，其包含至少一份单次使用的10μ 1-100 μ l鲁米诺溶液、10 μ 1-100 μ l的过氧化物酶溶液、10 μ 1-100 μ IFMLP溶液以及10 μ 1-100 μl PMA溶液等检测试剂。3.如权利要求1-2任一项所述试剂盒，其中所述一份单次使用的鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、FMLP溶液以及PMA溶液的量是欲检测精液体积的1/2至1倍。4.如权利要求1-3任一项所述试剂盒，其中当欲检测的精液为100μl时，所述一份单次使用的鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、FMLP溶液以及PMA溶液的用量为50 μ l ; 当欲检测的精液为200 μ l时，所述一份单次使用的鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、FMLP溶液以及PMA溶液的用量为100 μ l; 当欲检测的精液为150 μ l时，所述一份单次使用的鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、FMLP溶液以及PMA溶液的用量为75 μ l ; 当欲检测的精液为75 μl时，所述一份单次使用的鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、FMLP溶液以及PMA溶液的用量约为35-40 μ l ;或者 当欲检测的精液为50 μ l时，所述一份单次使用的鲁米诺溶液、过氧化物酶溶液、FMLP溶液以及PMA溶液的用量为25 μ l。5.如权利要求1-4任一项所述试剂盒，还包含阴性和/或阳性标准品。6.如权利要求1-5任一项所述试剂盒，还包含指导使用该试剂盒的说明...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨志行，施惠娟，杨春，孙玮洁，陈国武，文明，黄昌妹，朱冰美，胡慧超，吴婉欣，
申请(专利权)人：湖州海创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33