一种叶绿体铁转运基因NtPIC1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了烟草（Nicotianatabacumcv.SR-1）叶绿体铁转运基因NtPIC1及其编码蛋白在叶绿体铁转运中的应用。该基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示；其对应的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所示；它包含849bp的开放阅读框，编码282个氨基酸，预测的分子量为29.7kDa。其开放阅读框核苷酸序列在GeneBank上的登录号为KF640606。通过GFP融合蛋白细胞定位分析NtPIC1蛋白定位在叶绿体膜上。酵母功能互补实验证明该基因在酵母中的表达可有效的转运铁离子。本发明专利技术将所述基因NtPIC1导入到烟草中，获得了叶绿体高铁含量的转基因烟草，研究结果表明NtPIC1基因参与叶绿体铁转运及叶绿体的发育过程。

【技术实现步骤摘要】
一种叶绿体铁转运基因NtPIC1及其应用
本专利技术涉及烟草叶绿体铁转运基因NtPIC1的克隆及其在烟草叶绿体铁转运中的应用，属于植物基因工程领域。
技术介绍
铁是植物正常生命活动所必需的微量元素，位居植物必需微量元素的首位。铁参与多种生命活动代谢过程，包括光合作用，呼吸作用，叶绿素合成，是亚铁血红素和铁硫蛋白的重要成分。铁离子具有活跃的二价与三价的变化，是细胞内电子传递链所必需的组分。尽管地壳中的铁丰度很高，但土壤中可利用的Fe2+由于受土壤溶液pH值及氧分压的影响会形成不可溶的Fe3+，从而限制了土壤中铁的有效性，也限制了地球表面的大量金属铁的可利用性。在许多国家的干旱、半干旱地区的石灰性土壤及盐碱土壤上广泛存在着植物缺铁问题。植物缺铁失绿症是一个世界性植物营养失调问题，也是植物营养学研究的热点之一。植物缺铁会导致叶绿素合成减少，光合速率降低，严重缺铁时叶绿素合成停止，新叶变黄，生物量大幅度下降。植物缺铁不仅影响植物的生长发育，也造成巨大的经济损失，而且影响动物和人类对铁的获取，从而导致许多缺铁性疾病的发生。人类铁营养的缺乏已经成为当今世界最为严重的营养缺素症之一。当人体由于某种原因不能摄入足量的铁营养时，就会引起如Wilson、Pakinson、Menken及贫血病（anemia）等许多生理功能异常疾病，危及患者智力和体能的发育及身体健康。在高等植物中叶绿体是光合作用的位点，提供生命所必需的氧和碳。叶绿体含有叶肉细胞80%以上的铁，而类囊体膜上含有叶子中的60%的铁，叶绿体作为植物细胞中铁含量最丰富的系统，是金属铁离子主要的存在部位。因此，叶绿体中铁的吸收及利用与植物的生长和发育息息相关。第一个叶绿体铁转运基因PIC1首先在拟南芥中被发现，在其他物种中未见报道。铁离子转运在铁代谢过程中起关键作用，对植物生长、发育和抗逆性具有重要的意义。烟草（Nicotianatabacum）作为世界上重要的经济作物，它的质量和产量受到铁的严重影响。对于烟草叶绿体铁转运基因的获得与研究将为从基因工程培育高效铁吸收品种提供重要的理论基础，具有深远的实践意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一个烟草（Nicotianatabacumcv.SR-1）叶绿体铁转运基因NtPIC1及其在烟草叶绿体铁转运中的应用。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术通过RT-PCR的方法从烟草中克隆得到了NtPIC1基因的全长cDNA，该基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示，其编码的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示。本专利技术所述的基因NtPIC1，其在GeneBank中的登录号为KF640606。本专利技术提供的NtPIC1基因结构特性分析表明：NtPIC1基因cDNA全长为849bp,该基因编码282个氨基酸，蛋白分子量为29.7kDa，NtPIC1是疏水蛋白，含有基本的等电点，有四个跨膜结构域,包含70个氨基酸的叶绿体定位转运肽。经Southernblot检测该基因在烟草中为单拷贝基因。将其氨基酸序列在NCBI中Blast分析，发现与AtPIC1（拟南芥，AY057510）相比,氨基酸同源性为60%。采用GFP融合蛋白细胞定位的方法，分析表明该基因定位在叶绿体膜上。酵母功能互补实验证明该基因在酵母中的表达可以有效的转运铁。将本专利技术的烟草NtPIC1应用于叶绿体铁转运，具体为将含有本专利技术NtPIC1基因的植物表达载体导入到烟草中，培育筛选得到NtPIC1过表达植株转基因植物。具体步骤为：1）将烟草叶绿体铁转运基因NtPIC1核苷酸序列置于CaMV35S启动子之下，构建植物表达载体；2）将表达载体转入农杆菌LBA4404感受态细胞；3）利用2）获得的转化子转化烟草，获得转基因烟草植株。通过Real-timePCR方法对NtPIC1在过表达转基因烟草中的表达量进行了检测。结果显示，所获得的转基因植株中NtPIC1的表达量显著提高。对获得的转基因烟草进行叶绿体铁含量和叶绿素含量的测定，经分析表明，转基因植株与野生型相比较，叶绿体铁含量和叶绿素含量显著升高，叶片颜色呈明显深绿色。并且通过叶绿体亚显微观察,NtPIC1过表达转基因植株的叶绿体中类囊体膜堆叠更加密集且含有大量的淀粉粒，反应了更强的光合作用。综上所述，本专利技术获得的NtPIC1是一个叶绿体铁转运蛋白，位于叶绿体膜上，不仅对铁在叶绿体中的转运及叶绿体的发育起到重要作用，还具有重要的经济价值。本专利技术首次公开了一种烟草叶绿体铁转运基因NtPIC1，并获得了编码该基因的蛋白氨基酸序列，同时运用分子生物学及基因工程技术证实了烟草NtPIC1参与叶绿体铁转运及叶绿体的发育。同时基于此研究结果，为通过基因工程或分子育种提高叶绿体铁吸收利用和富集提供了必要的理论依据和技术支持，具有较大的应用前景。附图说明序列表SEQIDNO:1是本专利技术克隆的NtPIC1基因的核苷酸序列，序列长度为849bp。序列表SEQIDNO:2是NtPIC1基因编码的氨基酸序列。图1为NtPIC1蛋白的叶绿体膜定位结果。a-d表示GFP空载体转化原生质体；e-h表示GFP-NtPIC1融合蛋白定位在叶绿体膜上。图2为表达NtPIC1的酵母转化株的异源功能互补结果。图3为qRT-PCR分析过表达株系的NtPIC1表达量。图4为转基因烟草表型及叶绿体铁含量和叶绿素含量的测定。a为转基因植株的表型；b为转基因植株叶绿体的铁含量；c为转基因植株的叶绿素含量。WT，烟草野生型；OX，过表达株系。图5为转基因烟草叶绿体透射电镜显微观察。a-c野生型对照；d-fNtPIC1过表达植株。c，f分别是b，e中矩形部分的放大图像；S，淀粉颗粒。具体实施方式下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、一种烟草叶绿体铁转运基因NtPIC1全长cDNA克隆。从NCBI数据库中（(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索烟草的EST序列并保存，用数据库中已知的拟南芥AtPIC1序列在BioEdit软件中对保存的烟草EST序列文本文件进行LocalBlast，这样就获得了烟草中PIC1基因EST序列。利用该序列设计引物，引物为：NtPIC1-F1：5'-CGAACAAAACTAGCTATGCAAAC-3'；NtPIC1-R1：5'-GACTCCCAATCACTTCATGC-3'。具体流程如下：RNA的提取：利用TRIZOL试剂盒提取烟草（Nicotianatabacumcv.SR-1）幼叶RNA，反转录为cDNA，并以此cDNA为模板RT-PCR扩增NtPIC1全长序列。RT-PCR反应：用KOD-plusDNA聚合酶(Toyobo)进行RT-PCR反应，反应程序：94℃预变性2min；94℃变性15sec；57℃退火30sec；68℃延伸50sec；25个循环；72℃延伸10min。将RT-PCR产物5'末端磷酸化，将磷酸化后的片段克隆到pBluescriptIIsk+(Stratagene,California,USA)质粒载体中的EcoRV位点。重组质粒转化到大肠杆菌DH5α(Toyobo)中，将插入的核苷酸序列利用CEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟草叶绿体铁转运基因NtPIC1，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种烟草叶绿体铁转运基因NtPIC1，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的烟草叶绿体铁转运基因NtPIC1，其特征在于：该核苷酸序列编码的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示。3.含有权利要求1所述基因的表达载体。4.按照权利要求3所述的表达载体，其特征在于：该表达载体是植...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭长虹，龚勋，于典司，
申请(专利权)人：哈尔滨师范大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23