水稻Bph28基因在改良水稻抗褐飞虱性状方面的应用制造技术

本发明专利技术属于转基因技术领域，具体为水稻Bph28基因在改良水稻抗褐飞虱性状方面的应用。本发明专利技术利用来自普通野生稻的Bph28基因改良水稻抗褐飞虱性状,将栽培稻中的Bph28等位显性基因转化抗虫品种，覆盖隐性基因Bph28的表达，使抗虫品种的抗虫性状发生显著弱化，提供了该基因在水稻抗虫性状方面的重要功能。本发明专利技术还涉及改良水稻的褐飞虱抗性的方法、Bph28等位基因的表达载体、其制备方法及应用。

【技术实现步骤摘要】
水稻Bph29基因在改良水稻抗褐飞虱性状方面的应用
本专利技术属于转基因
，具体涉及Bph29基因的一种新的应用。本专利技术还涉及Bph29基因的的表达载体和一种改良水稻抗褐飞虱性状方法。
技术介绍
水稻是世界主要粮食作物，控制各种的水稻病虫害是亟待解决的严峻问题。在草食性水稻害虫中，对产量破坏性最强的就是褐飞虱。轻度的褐飞虱感染会导致作物株高降低，生长活力受抑，分蘖数亦受到抑制。而严重的褐飞虱感染会使作物完全枯萎，产生“叶蝉烧”现象。褐飞虱也可以成为水稻草矮病毒和水稻锯齿叶矮缩病毒的传播载体，在一些区域造成严重的疾病传播。近年来，褐飞虱感染问题在亚洲地区日渐严峻，农民多依赖化学杀虫剂来控制虫害，费工费时，极大的加重了环境的负担。最经济有效且环保可持续的虫害控制方法，是培育对褐飞虱具有广泛抗性的水稻品种并加以推广。多数研究表明，具有抗性的水稻品种能够抑制虫害的重量增长，并且大范围的几个世代后，可以显著降低褐飞虱的种群水平。迄今为止，有27个褐飞虱抗性基因在水稻栽培种及野生种中进行了定位，仅有一例被精确克隆到，水稻抗虫性的分子机理也不甚明了。而且，对于褐飞虱的抗性资源大多来自陆生籼稻，而来自粳稻的种质资源十分有限。同时，已有的提供抗性的野生稻品系均非栽培稻的AA基因组背景，因此在基因渗入之后，由于缺少与其原有的非AA基因组遗传背景的互作，转基因的抗性特征大大减弱。因此，发掘来自普通野生稻的新的抗性资源中的抗性基因十分重要。在未来，通过多基因互作来抵制褐飞虱的抗性也是十分重要的方向。
技术实现思路
本专利技术目的在于提出水稻Bph29基因在水稻抗褐飞虱性状弱化方面的应用及方法。本专利技术利用来自普通野生稻的Bph29基因改良水稻抗褐飞虱性状。实施例中，将栽培稻中的Bph29等位显性基因转化抗虫品种，覆盖隐性基因Bph29的表达，使抗虫品种的抗虫性状发生显著弱化，提供了该基因在水稻抗虫性状方面的重要功能。本专利技术提供了Bph29基因在水稻抗褐飞虱性状弱化方面的应用。例如，将Bph29基因转化水稻品种，以改良水稻抗褐飞虱性状。其中，所述的Bph29基因的序列如SEQIDNO1所示。本专利技术可以用于培育具有褐飞虱抗性的水稻，依次包括如下步骤：(1)构建Bph29等位基因表达载体；(2)Bph29等位基因表达载体转化水稻受体；(3)播种Bph29等位基因转化植株。其中，步骤(2)中采用抗虫野生稻BPHR54为转基因水稻受体，构建Bph29等位基因的过表达转基因植株。本专利技术还提供了一种Bph29等位基因的表达载体，是在pCAMBIA1304载体35S组成型启动子下游插入Bph29等位基因，将该表达载体应用于改良水稻抗褐飞虱性状。本专利技术所述的Bph29基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。本专利技术所述的Bph29基因还包括指编码具有水稻Bph29活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.1的简并序列。在本专利技术的另一方面，提供了一种表达水稻Bph29基因的方法，该方法包括：(a)将Bph29基因的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成Bph29基因表达载体，所述的核苷酸序列与SEQIDNO.1的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成含有Bph29基因的重组细胞；(c)在适合表达Bph29基因的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出目的蛋白。在本专利技术中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本专利技术多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。在本专利技术中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。本专利技术还包括：水稻Bph29基因的分离、克隆与转基因功能研究等。1)Bph29基因与蛋白结构组成水稻Bph29基因，基因序列全长612bp，无内含子。序列如SEQIDNO1.所示。cDNAgenbank登录号为KC019173，该登陆编码区序列全长612bp。编码203个氨基酸，序列如SEQIDNO2.所示。该基因的结构与其编码的蛋白质组成如下：水稻Bph29基因结构见图1所示。蛋白结构见图2所示，含有一个B3DNA-binding结构域。2)Bph29等位基因表达载体的构建采用pCAMBIA1304(CenterfortheApplicationofMolecularBiologyofInternationalAgriculture,Canberra,ACT,Australia)为表达载体，将籼稻118S的Bph29等位基因插入到pCAMBIA1304载体35S组成型启动子下游，得到含Bph29等位基因的表达载体。其结构图如图3所示。3)Bph29等位基因转化实验采用具有高级别抗褐飞虱性状的野生稻品种BPHR54为转基因受体，构建Bph29等位基因表达的转基因植株。将BPHR54成熟种子去壳消毒后接种在脱分化植物组织培育基上诱导愈伤组织。在愈伤组织诱导2-3周后，采用基因枪微弹轰击法，将含Bph29等位基因的经纯化的pCAMBIA1304质粒DNA导入BPHR54愈伤组织细胞。在添加30ppm潮霉素的MS培养基上连续培养3-4周筛选抗性细胞系，然后将筛选的细胞系转移到分化培养基诱导长芽和生根。4)转化处理试管苗移载及转化植株后代的分子检测将Bph29等位基因转化处理的BPHR54试管苗移载田间，并在分蘖期取叶片提取DNA采用PCR扩放技术进行分子检测，于2011年夏获得阳性T0代植株。2011年冬，在海南岛加代繁殖，获得转基因T1代，共计7个株系。5)Bph29等位基因转化野生稻BPHR54转基因植株的PCR检测目的基因在野生稻BPHR54对照植株中不表达，而在转基因植株中表达。见图4所示。6)Bph29转基因T1代群体抗虫性状的调查与统计将转基因T1代于2012年夏播种，种植在广西农科院植保所网室。三叶期时对其进行抗虫鉴定。取5个转基因株系，每个株系约种植20株，10株x2列。同时设立野生型敏感亲本与BPHR54抗虫亲本作为对照，统计各株系的抗虫级数，统计结果如下：根据上述抗虫鉴定结果与对照相比，转基因品系中，Bph29基因被等位显性基因覆盖后的抗虫性状显著回复接近敏感亲本级别，证明了Bph29基因在提供抗虫性状中的重要作用。转基因植株抗虫鉴定结果见图5所示。本专利技术利用来自普通野生稻的Bph29基因改良水稻抗褐飞虱性状,将栽培稻中的Bph29等位显性基因转化抗虫品种，覆盖隐性基因Bph29的表达，使抗虫品种的抗虫性状发生显著弱化，提供了该本文档来自技高网...

【技术保护点】
Bph28基因在改良水稻抗褐飞虱性状方面的应用。

【技术特征摘要】
1.Bph29基因在水稻抗褐飞虱性状弱化方面的应用，所述的Bph29基因的序列如SEQIDNO1所示。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，培育具有褐飞虱抗性弱化的水稻，依次包括如下步骤：(1)构建Bph29等位基因表达载体；(2)Bph29等位基因表达载体转化水稻受体；(3)播种Bph29等位基因转...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗小金，王莹，杨金水，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31