用于脑膜炎球菌中增加的蛋白表达的启动子制造技术

描述了新启动子来驱动脑膜炎球菌中的转录，例如用于过表达蛋白抗原以保持在膜囊泡中。经修饰的porA启动子缺少可以造成相转变的野生型聚-G序列。可以使用脑膜炎球菌rRNA编码基因(例如，编码16S rRNA)来驱动蛋白编码基因的转录。这些方法可以组合使用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于脑膜炎球菌中增加的蛋白表达的启动子 本申请要求2012年2月2日提交的美国临时专利申请61/594, 159的优先权，其 全部内容通过引用纳入本文。
本专利技术属于用于在脑膜炎球菌中控制转录的启动子的领域。
技术介绍
脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis)是细菌性脑膜炎的病因。脑膜炎球 菌疫苗接种的一个方法依赖于外膜囊泡（0MV)，如在诺华（Novartis)MENZB?产品和挪威公 共卫生研究院（Norwegian Institute of Public Health)MENBVAC?产品中所使用，两者都 通过脑膜炎球菌的去污剂处理产生。 已知改变脑膜炎球菌外膜的蛋白组成，并且因此改变0MV的组成。已经描述了敲 除不需要的基因并且过表达需要的基因。参考文献1-2, 3报道了 0MV疫苗的临床前研究， 其中fHbp (也称为GNA1870)过表达（并且这种过表达可以与LpxLl [4]的敲除结合）。参 考文献5报道了 5种配方的0MV疫苗的临床研究，其中敲除了 PorA和FrpB并且过表达Hsf 和TbpA。参考文献6报道了由具有灭活的synX和lpxLl基因、过表达的fHbp、两种不同的 PorA蛋白和稳定化的OpcA表达的细菌制备的天然外膜囊泡疫苗的I期临床研究。参考文 献7报道了由具有灭活的synX和lpxLl基因（和，在两个情况中，灭活的lgtA)、两种不同 的PorA蛋白和过表达的NadA或fHbp的细菌制备的三价天然外膜囊泡疫苗。如果通过不 去除LPS的方法产生囊泡，诸如lpxLl的基因的灭活是重要的。 蛋白组成中的这些变化可以多种方式实现。例如，细菌可以在铁限制条件下生长 以促进与铁代谢相关的某些蛋白的表达。其他技术可以包括对细菌的工程改造。例如，参 考文献8提出可以使用强启动子（诸如porA、porB、lgtF或hpuAB启动子）来上调保护性 外膜蛋白的表达，或可以去除抑制性转录控制机制。参考文献9提出可以对基因进行工程 改造以去除它们的相可变性。在参考文献7中使用porA启动子来过表达NadA，而使用tac 启动子过表达fHbp。 本专利技术的目标是进一步提供并且改善在脑膜炎球菌中改变蛋白表达的方式，并且 尤其是提供用于驱动感兴趣基因的表达的启动子。可以使用上调来增加在0MV中有用蛋白 的水平。
技术实现思路
本专利技术的第一方面使用经修饰的porA启动子来驱动转录。如参考文献8的实施 例10-16中使用的天然porA启动子在其-35到-10区域之间含有聚-G序列，但是该序列 可能造成相转变并且因此来自天然porA启动子的表达可能不稳定。本专利技术的经修饰porA 启动子有改善，因为它们缺少野生型聚-G序列。 因此，本专利技术提供了包含启动子的核酸，其包括： (i)来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-10区域和/或 (ii)来自脑膜炎球菌P〇rA基因启动子的-35区域， 其中-10区域和-35区域通过12-20个核苷酸的间插（或间隔子）序列隔开，并 且其中间插序列不含聚-鸟噪呤（guanidine)序列或者包括具有不超过8个连续鸟噪呤核 苷酸的聚-鸟嘌呤序列。 本专利技术的第二方面使用来自脑膜炎球菌rRNA编码基因（诸如16S rRNA基因）的 启动子来驱动蛋白编码基因的转录。因此本专利技术也提供包含与下游的蛋白编码基因可操作 连接的启动子的核酸，其中该启动子包括（i)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-10区域 和/或（ii)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-35区域。 本专利技术也提供包含来自与具有5' UTR的蛋白编码基因可操作连接的rRNA基因启 动子的启动子区域的核酸，所述5' UTR含有蛋白表达的翻译调节元件。启动子区域可以包 括⑴来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-10区域，（ii)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动 子的-35区域，和（iii)来自基因如porA基因的5' UTR。 本专利技术也提供了包含启动子的核酸，其包括SEQ ID N0:18,或SEQ ID N0:18的变 体，所述变体与SEQ ID NO :18之间存在最多4个（例如，1、2、3或4个）单核甘酸插入、删 除或取代的差异。 可以杂合形式使用porA和rRNA启动子，例如具有来自porA启动子的-10区域和 来自rRNA启动子的-35区域（其可以是共有的-35区域）。因此，本专利技术也提供了包含启 动子的核酸，其包括： ⑴来自脑膜炎球菌rRNA基因的-10区域和来自脑膜炎球菌porA基因的-35区 域，或 (ii)来自脑膜炎球菌porA基因的-10区域和来自脑膜炎球菌rRNA基因的-35区 域。 本专利技术的核酸可以在细菌中存在，并且尤其是在脑膜炎球菌中。启动子可以驱动 与之可操作连接的下游蛋白编码基因的表达（尤其是编码外膜蛋白的基因），并且可以使 用该细菌来制备疫苗（尤其是基于囊泡的疫苗）。本专利技术也提供了这些细菌、这些囊泡和这 些疫苗。 本专利技术的启动子 细菌启动子中的两个基本序列是-10区域（也称为Pribnow盒）和-35区域。通 过间插序列分隔这些区域，并且在-10区域和转录起始位点（+1)之间是短非转录上游序 列。 已经详细研究了 PorA启动子。参考文献10报道了 6聚体的-35区域，之后是16 聚体或17聚体的间插序列，然后是7聚体Pribnow盒，然后是7-聚体非转录上游序列，之 后是转录核苷酸+1。在野生型porA基因中的起始密码子在转录体的核苷酸+59,并且在参 考文献8中证明了这个59聚体间隔。 在本专利技术的启动子包括来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-10区域的情况中，这 通常是6聚体TATAAT，即典型的-10区域6聚体。 在本专利技术的启动子包括来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-35区域的情况中，这 通常是6聚体TGGTTT或ATGGTT。 在-35区域和-10区域之间的间插序列可以是12-20个核苷酸，例如12、13、14、 15、16、17、18、19或20个核苷酸。16、17或18个核苷酸的间插序列是典型的。 短非转录上游序列通常是5-10个核苷酸，例如6、7或8个核苷酸。其可以是富G : C的，例如在序列中至少1/2的核苷酸是G或C，例如在6聚体非转录上游序列中至少3个 G/C残基。 因此，启动子可以包括6聚体-35区域、16聚体或17聚体间插序列、6聚体-10区 域和6聚体或7聚体非转录上游序列，得到总共34、35或36个核苷酸的核心启动子。 启动子当然可以在-35区域上游连续。-35区域上游的序列对于来自该启动子的 高水平表达、来自该启动子的表达调节可能是重要的。例如，在rRNA启动子中核心启动子 上游称为UP-元件的序列能够解释它们提高转录高达300倍的突出力度[11，12]。这些可 以由RNA聚合酶核心的α-亚基所识别。因此本专利技术的启动子可以包括上游UP-元件，其 通常是富A :T的。相似地，本专利技术的启动子可以包括上游的CREN(奈瑟球菌的接触调控元 件）[13]。 在本专利技术的启动子包括来自porA基因启动子的-35区域和/或-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含启动子的核酸，所述启动子包括(i)来自脑膜炎球菌porA基因启动子的‑10区域和(ii)来自脑膜炎球菌porA基因启动子的‑35区域，其中所述‑10区域和‑35区域由12‑20个核苷酸的间插序列隔开，并且其中所述间插序列不含聚‑G序列或者包括具有不超过8个连续G核苷酸的聚‑G序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.02.02 US 61/594,1591. 一种包含启动子的核酸，所述启动子包括 (i) 来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-10区域和 (ii) 来自脑膜炎球菌P〇rA基因启动子的-35区域， 其中所述-10区域和-35区域由12-20个核苷酸的间插序列隔开，并且其中所述间插 序列不含聚-G序列或者包括具有不超过8个连续G核苷酸的聚-G序列。2. -种包含与下游的蛋白编码基因可操作连接的启动子的核酸，其特征在于，所述启 动子包括⑴来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-10区域和/或（ii)来自脑膜炎球菌 rRNA基因启动子的-35区域。3. -种包含与蛋白编码基因可操作连接的启动子区域的核酸，所述启动子区域来自脑 膜炎球菌rRNA基因启动子，所述蛋白编码基因具有5' UTR，所述5' UTR含有用于表达所 述蛋白的翻译调节元件。4. 一种包含启动子的核酸，所述启动子包括来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-10区 域和来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-35区域。5. -种包含启动子的核酸，所述启动子包括SEQ ID N0:18,或SEQ ID N0:18的变体， 所述变体与SEQ ID NO :18之间存在最多4个单核甘酸插入、删除或取代的差异。6. 如前述权利要求中任一项所述的核酸，其特征在于 所述-10区域是TATAAT ; 所述来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-35区域是TGGTTT ;和/或 所述来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-35区域是TTGACA。7. 如前述权利要求中任一项所述的核酸，其特征在于，所述在-35区域和-10区域之间 的间插序列具有12-20个核苷酸，例如，SEQ ID N0:27或SEQ ID N0:28或SEQ ID N0:29。8. 如权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述间插序列不包括序列GGGGG。9. 如前述权利要求中任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：I·德莱尼，S·瓜达诺罗，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH