一种制备冷沉淀的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种冷沉淀的制备方法，包括以下步骤：(1)取-20℃冻存的健康人血浆，24小时内升温到-15℃至-5℃；(2)在不高于37℃循环水条件下，使血浆完全融化，(3)将血浆温度控制在-2℃至5℃，静置3-9个小时；(4)离心，得到冷沉淀。经对比试验验证，是以普通冷沉淀为原料制备得到的人凝血因子VIII比活的约4倍，远远高于目前中国药典规定的1IU/mg的标准，本领域公知，人凝血因子VIII非常的昂贵，比活的大大提高，意味着经济效益的巨大提升，工业应用前景良好。

【技术实现步骤摘要】
一种制备冷沉淀的方法及其应用
本专利技术涉及血液制品的制备工艺，具体涉及一种制备高比活冷沉淀的方法，以及这种冷沉淀在生产人凝血因子VIII生产中的应用。
技术介绍
冷沉淀是由新鲜冰冻血浆制备的成分血，是新鲜冰冻血浆(FFP)在4℃下融化后残留的白色冷沉淀物，主要含有第Ⅷ因子、纤维蛋白原、血管性血友病因子(VWF)、第ⅩⅢ因子以及纤连蛋白等成分，是制备人凝血因子Ⅷ制剂的原料。现有的从血浆中制备冷沉淀的方法有两种：快速融化离心法和虹吸法。因为虹吸法制得的冷沉淀中人凝血因子VIII含量低，工业上通常采用快速融化离心法来制备冷沉淀，其基本步骤为：将冰冻血浆置于4℃水浴装置中融化，当血浆基本融化后，在低温环境下离心，提取冷沉淀(见李忠平，李瑞兰，“用快速融化离心法制备冷沉淀”，中国输血杂志1994年第7卷第1期，P20-22)。之后，在此基础上又提出了一种改良快速融化离心法，即用冰块将水浴箱内水温降至4℃，而后将新鲜冰冻血浆放入水浴箱，待新鲜冰冻血浆融化到一半多的时，将还未融化的血浆捏散成碎冰块，以加速其溶解。调控水温使之恒定在4℃继续融化。约2小时后，待新鲜冰冻血浆尚存少许碎冰块时及时取出,离心10min,离心力3000×g，温度0℃。在净化室内100级净化台上操作分离出上层血浆，下层(25ml±5ml)血浆和白色沉淀物即为冷沉淀(见巩玉梅，唐国俊，王明珠，严颂旭，“两种制备冷沉淀方法的比较及临床效果观察”，中国公共卫生管理2009年第25卷第5期，P534)。这种改良的思路是缩短融化时间，一边融化一边离心，但是在容量控制方面要求高，如果离心前碎冰块的量过多，冷沉淀的容量则会超量，过少则会影响冷沉淀的沉积。在实际的工业生产中，快速融化血浆常常使用到热媒，温度控制较为困难，提取冷沉淀不够均匀。而且，上述方法制得的冷沉淀的量较少，通常每吨血浆仅得到8.9kg冷沉淀，冷沉淀中人凝血因子Ⅷ的比活为39.951IU/g(见营长永等，“人凝血因子VIII分离纯化工艺研究”，山东大学硕士学位论文)，而且对冷沉淀进一步分离纯化制得的人凝血因子Ⅷ制剂的量也比较少，造成血浆资源的浪费。因此，寻找其他方式来改良冷沉淀的制备方法，以获得稳定的、高比活的冷沉淀，并将其应用于生产人凝血因子VIII，对工业生产和提高血浆利用率都有重要的意义。
技术实现思路
为解决现有技术的问题，本专利技术提供了一种制备冷沉淀的新方法，以及这种冷沉淀在人凝血因子VIII(即：FVIII)生产中的应用。本专利技术提供的一种冷沉淀的制备方法，包括以下步骤：(1)取-20℃冻存的健康人血浆，24小时内升温到-15℃至-5℃；(2)在不高于37℃循环水条件下，使血浆完全融化；(3)将血浆温度控制在-2℃至5℃，静置3-9个小时；(4)离心，得到冷沉淀。其中，步骤(1)中的健康人血浆冻存时间不超过1年；步骤(2)中，本领域也可以将完全融化后的血浆称为血浆池；所处理的血浆量的大小或血浆池的大小，依设计能力不同而不同，从现有处理能力来看，处理1000～9000袋血浆(590～600g/袋)，形成500～5000L的血浆池，均为合宜的；如果有适宜的设备，处理更大量的血浆，也是可能的。进一步的，步骤(3)所述的血浆温度为-1至3℃，所述静置时间为4-7小时；按照本专利技术步骤(3)的条件处理后得到的冷沉淀性质基本恒定。步骤(4)中，离心机转速为14000转/min，离心速度为0.5～4.5L/min.台次，优选速度为1.5～3.5L/min.台次；优选的，步骤(4)中所述离心采用高速管式离心机。步骤(4)提取得到的冷沉淀的可以采用以下方法进行冻存：将冷沉淀切割为长×宽×高不超过280×200×20mm的尺寸，置于一次性PET包装盒中于-60至-80℃存放。本专利技术的另一方面涉及由本专利技术上述方法制备得到的冷沉淀。本专利技术还涉及所述冷沉淀在制备人凝血因子Ⅷ中的用途。可以采用现有方法，制备人凝血因子Ⅷ，其工艺路线为：将冷沉淀在氨丁三醇(Tris)缓冲液中溶解；使用铝胶/聚乙二醇吸附/沉淀；离心去沉淀；SD病毒灭活处理；阴离子交换层析后，超滤配制得到人凝血因子Ⅷ；如文献：离子交换层析法制备人高纯FVIII制剂，罗亮等，华西药学杂志，2000,15(3)：174～176)公开的方法，但是本专利技术的制备方法中，不需要专门对冷沉淀进行洗涤或10℃～15℃条件下进行酸沉淀结合PEG沉淀。按照以上步骤，可以获得比活最高达到157IU/mg的人凝血因子Ⅷ。经对比试验验证，是以普通冷沉淀为原料制备得到的人凝血因子VIII比活的约4倍，远远高于目前中国药典规定的1IU/mg的标准，本领域公知，人凝血因子VIII非常的昂贵，比活的大大提高，意味着经济效益的巨大提升，工业应用前景良好。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1工艺流程图具体实施方式实施例1本专利技术冷沉淀的制备方法1)取新鲜冰冻血浆约1800袋(590～600g/袋)新鲜冰冻血浆指：新鲜健康人血浆采集后，-20℃保存，不超过1年；将新鲜冰冻血浆置于-10℃的低温冷库中，在24小时以内使血浆升温至-5至-15℃进行预融；2)不高于37℃循环水融化，经2小时已完全融化，形成约1000L的均一血浆(或称血浆池)；3)血浆(池)温度控制在-2℃至5℃，静置9小时；4)采用高速管式离心机离心提取冷沉淀，离心机转速14000转/min，离心速度为0.5～4.5L/min.台次，弃去上清，得到冷沉淀；可以立即用于制备人凝血因子Ⅷ；如果不马上使用，可以用以下方法进行保存；5)保存将提取的冷沉淀切割为长×宽×高不超过280×200×20mm的尺寸，置于一次性PET包装盒中于-60至-80℃存放。实施例2本专利技术冷沉淀的制备方法1)取新鲜血浆约4200袋新鲜健康人血浆采集后，-20℃保存，不超过1年；将新鲜冰冻血浆置于-10℃的低温冷库中，在24小时以内使血浆升温至-5至-15℃进行预融；2)不高于37℃循环水融化，经6小时形成约2500L的均一血浆池；3)血浆池温度控制在-1℃至3℃，静置6小时；4)采用高速管式离心机离心提取冷沉淀，离心机转速14000转/min，离心速度为0.5～4.5L/min.台次；弃去上清，得到冷沉淀；可以立即用于制备人凝血因子Ⅷ；如果不马上使用，可以用以下方法进行保存；5)保存将提取的冷沉淀切割为长×宽×高不超过280×200×20mm的尺寸，置于一次性PET包装盒中于-60至-80℃存放。实施例3本专利技术冷沉淀的制备方法1)取新鲜血浆约4200袋新鲜健康人血浆采集后，-20℃保存，不超过1年；将新鲜冰冻血浆置于-10℃的低温冷库中，在24小时以内，使血浆升温至-5至-15℃进行预融；2)不高于37℃循环水融化，经6小时形成约2500L的均一血浆池；3)血浆池温度控制在-1℃至3℃，静置3小时；4)采用高速管式离心机离心提取冷沉淀，离心机转速14000转/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种冷沉淀的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)取‑20℃冻存的健康人血浆，24小时内升温到‑15℃至‑5℃；(2)在不高于37℃循环水条件下，使血浆完全融化，(3)将血浆温度控制在‑2℃至5℃，静置3‑9个小时；(4)离心，得到冷沉淀。

【技术特征摘要】
1.一种冷沉淀的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)取-20℃冻存的健康人血浆，24小时内升温到-15℃至-5℃；(2)在不高于37℃循环水条件下，使血浆完全融化，(3)将血浆温度控制在-2℃至5℃，静置3-9个小时；(4)离心，得到冷沉淀。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中的健康人血浆冻存时间不超过1年。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的血浆温度为-1至3℃。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述静置时间为4-7小时。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，离心机转速为14000转/min，离心速度为0.5～4.5L/min.台次。6.根据权利要求5所述的制备方...

【专利技术属性】
技术研发人员：余鼎，杨汇川，杨宇，赵磊，赵海平，
申请(专利权)人：成都蓉生药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：四川;51