本发明专利技术公开了一种全细胞催化产乳果糖的方法，属于食品生物技术领域。本发明专利技术以产纤维二糖差向异构酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)作为生产菌株，以乳糖替代异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂进行发酵培养，离心所得菌体经乙醇透化、真空冷冻干燥处理作为细胞生物催化剂，直接转化乳糖生产乳果糖。乳果糖转化率最高可达65.1％，乳果糖浓度达到390.6g/L，乳果糖的生产率达到195.3g/(L·h)，而副产物依匹乳糖生成量小于2％(w/w)。本发明专利技术直接利用微生物细胞转化乳糖生产乳果糖，方法简单易行，同时避免了分离纯化过程中酶活的损失，大大降低了酶法生产乳果糖的成本，有助于早日实现酶法生产乳果糖的工业化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于食品生物
。
技术介绍
近年来，肥胖、糖尿病和心血管疾病人群呈现逐年增加和低龄化的趋势，使得低热量、具有更多功能特性的功能性甜味剂成为广大食品从业者研发和关注的焦点。世界上有70%的人具有乳糖不耐症，食用乳糖后会引起严重的胃肠道问题，每年世界上有几百万吨的乳糖因得不到进一步利用而被白白浪费同时引起环境污染，如何高效地利用乳糖成为急需解决的难题。而通过乳糖异构化得到的乳果糖以其优越的功能特性正成为广大消费者和食品从业者关注的新热点。乳果糖(4-0- β -D-吡喃半乳糖基-D-果糖)为乳糖异构化产物，是一种人工合成的且不能被人体消化吸收的功能性低聚糖。1957年奥地利学者Petuely发现，通过添加乳果糖，可使人工哺喂的婴儿肠道菌群与母乳哺喂的婴儿相接近，首次证实了乳果糖是一种双歧杆菌增殖因子。在日本，乳果糖被认定为“特定保健用食品”添加剂而得以广泛使用。目前在世界范围内，乳果糖被广泛应用于医药、保健、食品添加剂以及动物饲料等行业。在临床医药行业，乳果糖主要用于治疗肝性脑病、便秘、内毒素以及降血糖、降胆固醇等，在食品行业中被广泛添加到婴幼儿奶粉、软饮料以及保健品中，主要是发挥其双歧杆菌增殖因子的作用。目前全球每年乳果糖的产量已超过60000吨，国内乳果糖生产企业仅有大连化工研究设计院、丹东康复制药有限公司等少数企业，产品为低纯度乳果糖糖浆，国内药用级高纯乳果糖几乎全部依赖进口。且国内工业化生产均依靠化学法，酶法生产乳果糖还未实现产业化。化学法生产乳果糖具有转化率高、可实现大规模生产等优点，但是化学异构化法的缺点也很突出，如反应副产物多、脱盐操作复杂、能耗高以及存在安全隐患问题等。为了克服化学异构法存在的各种弊端，生物酶法转化乳糖制备乳果糖因其制备的产物单一，天然无毒，符合广大消费者追求天然产品的消费心理而成为目前的研究热点。目前用于生产乳果糖的酶主要有糖苷酶、半乳糖苷酶以及来源于Caldicellulosiruptor saccharolyticus的纤维二糖差向异构酶。其中β-糖苷酶以及β_半乳糖苷酶的转化率比较低(7.5-30%)，得其不适合乳果糖的工业化生产。使用纤维二糖差向异构酶的纯酶进行乳果糖的酶法生产时，在反应体系中需添加大量硼酸，硼酸是一种对人体有害的物质，脱除硼酸需要采用膜分离技术结合昂贵的脱硼树脂，这会增大乳果糖工业生产的成本，同时带来食品安全隐患。如何有 效避免上述问题而实现乳果糖的高效酶法生产必将成为食品工业从业者面临的新任务。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一株异源表达纤维二糖差向异构酶的基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主、以pET-28a(+)为表达载体，表达核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示的纤维二糖差向异构酶。所述大肠杆菌优选E.coli BL21 (DE3)。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供一种诱导所述基因工程菌表达纤维二糖差向异构酶的方法，是利用IPTG或乳糖诱导重组E.coli BL2KDE3)发酵产纤维二糖差向异构酶。所述方法优选以构建好的产纤维二糖差向异构酶的重组大肠杆菌E.COliBL21(DE3)作为生产菌株，经活化、扩大培养至对数期0D_ = 0.2-2.0时加入异丙基- β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.05-1.2mM或者加入乳糖至终浓度为0.5_50g/L, 15-45°C，150-250r/min摇床培养8_24h，离心收集菌体。本专利技术要解决的第三个技术问题是提供一种利用所述基因工程菌全细胞催化生产乳果糖的方法，主要包括以下步骤:(I)以乳糖诱导培养重组E.coli BL21 (DE3)产纤维二糖差向异构酶；(2)收集培养得到的菌体通过乙醇透化、真空冷冻干燥处理作为细胞生物催化剂；(3)将细胞生物催化剂直接用于转化乳糖生产乳果糖。所述步骤⑵优选将IL发酵液中离心收集到的菌体悬浮于l-100mLl-90% (v/v)的乙醇中，4-30°C下混匀5-120min进行透化处理，离心收集沉淀，经真空冷冻干燥得到的菌粉4°C条件下保存，菌粉作为细胞生物催化剂直接用于转化乳糖生产乳果糖。用乳糖诱导的全细胞透化后的酶活为300-400U/g。所述透化处理时优选40% (v/v)乙醇。所述步骤⑶优选以下步骤:①将乳糖以缓冲液配制成50_800g/L，调节pH至6.0-9.5作为底物溶液；②将细胞生物催化剂加入底物溶液，转化条件为:底物乳糖浓度50_800g/L，生物催化剂以冻干菌粉的酶活计对底物溶液的用量为1-lOOU/mL，初始pH6.0-10.0，反应温度为40-95°C，反应时间为l-24h。所述底物乳糖浓度优选600g/L，菌粉添加量优选12.5U/mL，反应温度优选80°C，反应优选时间3h。所述底物溶液配制时所用的缓冲液为=Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、PIPES缓冲液、Na2HPO4-柠檬酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、Britton-Robinson缓冲液以及水溶液中的一种。本专利技术以构建的产纤维二糖差向异构酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)作为生产菌株，以乳糖替代IPTG作为诱导剂诱导产纤维二糖差向异构酶，收集到的菌体通过乙醇透化、真空冷冻干燥处理作为细胞生物催化剂，以乳糖作为单一底物在不同的缓冲液体系中转化乳糖生产乳果 糖。乳果糖转化率最高可达65.1%，乳果糖浓度达到390.6g/L，乳果糖的生产率达到195.3g/(L.h)，而副产物依匹乳糖生成量小于2% (w/w)。本专利技术先利用乳糖替代IPTG作为产酶诱导剂，为重组大肠杆菌的工业化发酵生产提供参考，同时直接利用经冷冻干燥得到的游离细胞、透化细胞作为细胞生物催化剂转化乳糖生产乳果糖，有效避免了胞内酶在破碎、提取以及分离纯化过程中的酶活损失，有效降低了酶法生产乳果糖的成本，为工业上酶法生产乳果糖提供参考和借鉴。该方法在磷酸盐缓冲液体系中催化转化乳糖生产乳果糖时，磷酸盐无毒且用量较小，同时在磷酸盐体系中副产物依匹乳糖的量小于2% (w/w)，简化了后续的分离纯化，为高纯度乳果糖的酶法生产提供一种新思路。该专利技术通过生物酶法制备乳果糖，产物清洁无毒，分离纯化过程相对简单且能耗小，有利于实现资源节约型、环境友好型生产，同时为促进洁净、高效、环保的酶法生产乳果糖的工业化生产提供有益的借鉴。【具体实施方式】纤维二糖差向异构酶的游离酶的酶活定义为:在80°C，pH7.5,50mM Tris-HCl缓冲液中，每分钟催化乳糖生成Iymol乳果糖所需的酶量定义为1U。测定酶活时，反应底物乳糖浓度为50g/L，反应时间20min。全细胞菌粉的酶活的测定:取0.0I g经冷冻干燥的菌粉，溶于ImL pH7.550mMTris-HCl缓冲液中，混合均匀后取100 μ L菌悬液加入到900 μ L乳糖溶液中，最终体系乳糖浓度为50g/L,混合均匀后在80°C下反应20min,沸水浴灭酶5min后取样测定体系中生成的乳果糖的量，以每分钟催化乳糖生成I μ mol乳果糖所需的全细胞菌粉量定义为1U，后续的加酶量以菌粉的酶活力计量。乳果糖的化学法测定:在酸性条件下水解乳果糖，水解产物与半胱氨酸盐酸盐-色氨酸显色剂反应，在518nm处本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株异源表达纤维二糖差向异构酶的基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的纤维二糖差向异构酶。
【技术特征摘要】
1.一株异源表达纤维二糖差向异构酶的基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的纤维二糖差向异构酶。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌是E.coliBL21 (DE3)，以 pET-28a(+)为表达载体。3.一种诱导权利要求1所述基因工程菌表达纤维二糖差向异构酶的方法，是利用IPTG或乳糖诱导重组大肠杆菌发酵产纤维二糖差向异构酶。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以构建好的产纤维二糖差向异构酶的重组大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)作为生产菌株，经活化、扩大培养至对数期OD6tltl = 0.2-2.0时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度0.05-1.2mM或者加入乳糖至终浓度为.0.5-50g/L, 15-45°C, 150-250r/min摇床培养8_24h，离心收集菌体，获得表达了纤维二糖差向异构酶的重组大肠杆菌。5.一种应用权利要求1所述基因工程菌全细胞催化产乳果糖的方法，其特征在于，主要包括以下步骤:(I)以乳糖诱导培养重组E.coli BL21(DE3)产纤维二糖差向异构酶；(2)收集培养得到的菌体通过乙醇透化、真空冷冻干燥处理作为细胞生物催化剂；(3)将细胞生物催化剂直接用于转化乳糖生产乳果糖。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)将IL...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨瑞金，汪明明，华霄，张文斌，沈秋云，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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