一种CD7纳米抗体、其编码序列及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种人CD7纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，框架区FR选自的FR1～FR4的氨基酸序列，互补决定区CDR选自的CDR1～CDR3的氨基酸序列，本发明专利技术还公开了一种人CD7纳米抗体，还公开了一种DNA分子，它编码本发明专利技术所述的人CD7纳米抗体的VHH链，或人CD7纳米抗体，还公开了一种宿主细胞，它能表达针对人CD7的纳米抗体，还公开了该抗体用于检测人CD7分子、流式检测和细胞免疫荧光实验的用途。通过本发明专利技术所公布的纳米抗体基因序列和宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于CD7分子检测试剂的研发。

【技术实现步骤摘要】
一种CD7纳米抗体、其编码序列及应用
本专利技术属于生物医学或生物制药
，涉及一种针对于人CD7分子的纳米抗体、其编码序列及应用。
技术介绍
1993年，Hamers-Casterman和他的同事在骆驼科动物体内发现了一种特殊类型的抗体，即天然缺失轻链的重链抗体(Heavychainantibodies,HCAbs)，克隆其可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体(singledomainantibody,sdAb)，其晶体结构呈椭圆形,直径2.5nm,高度4nm,所以又被称为纳米抗体(Nanobodies，Nb；15kDa)，它是现阶段最小的功能性抗原结合片段。纳米抗体和常规抗体相比具有许多独特的性质：1)纳米抗体编码的序列与人VH家族3和4同源性高，使得它免疫原性弱；2)纳米抗体分子量小，仅15kDa左右,结构简单，很容易在微生物中大量表达，易于纯化；3)纳米抗体可以识别大量的抗原表位，包括一些藏在分子裂缝中的表位都能识别；4)由于纳米抗体分子量小，使得它们易于穿透组织，到达常规抗体难以到达的部位；5)在变性或者高温环境下纳米抗体具有高可溶性和稳点性。人CD7分子是一个分子量约40kDa细胞表面糖蛋白属于免疫球蛋白超家族中的一员。CD7分子主要表达在大多数的胸腺细胞表面，85％以上的外周血T淋巴细胞表面以及自然杀伤细胞表面。尽管目前的研究表明CD7分子的具体功能还不太清楚，但实验显示CD7缺陷的鼠T淋巴细胞对刺激反应正常以及当抗体与人T淋巴细胞上的CD7分子结合后对细胞的生长和增殖并没有影响。同时，CD7分子的一个重要性质是当它和它的抗体结合后会快速的发生内吞作用。在这个重要性质的基础上，已经有几项研究通过在CD7分子上偶联免疫毒素来靶向递送到人白血病以及淋巴癌细胞，从而达到治疗疾病的目的以及偶联免疫毒素来治疗急性移植物抗宿主病。这些实验都已进行临床实验阶段。同时有研究通过在CD7分子上偶联蛋白来靶向递送siRNA到T淋巴细胞内，来治疗HIV感染。但是这些实验都是在常规抗体中分离出来的单链抗体(scFv；30kDa)上进行的。由于单链抗体相对纳米抗体分子量较大，导致其侵入组织和细胞中困难，而纳米抗体由于分子量很小同时单链抗体在原核表达系统中很难可溶表达出来，而纳米抗体在原核表达系统中易可溶表达且易复性。所以制备人CD7纳米抗体来进行疾病治疗研究可能是更加有效的且研究成本较低的备选方案之一。目前，也没有针对人CD7抗原表位为靶标的特异性纳米抗体的研究报道。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供一种针对人CD7分子的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测的应用。技术方案：为实现上述目的，本专利技术的第一方面，一种人CD7纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自以下的FR1～FR4的氨基酸序列：SEQIDNO.1所示的FR1，SEQIDNO.2所示的FR2，SEQIDNO.3所示的FR3，SEQIDNO.4所示的FR4；或SEQIDNO.5所示的FR1，SEQIDNO.6所示的FR2，SEQIDNO.7所示的FR3，SEQIDNO.8所示的FR4；或SEQIDNO.1所示的氨基酸序列FR1，SEQIDNO.9所示的FR2，SEQIDNO.3所示的FR3，SEQIDNO.4所示的FR4；SEQIDNO.5所示的FR1，SEQIDNO.10所示的FR2，SEQIDNO.11所示的FR3，SEQIDNO.12所示的FR4；或SEQIDNO.13所示的FR1，SEQIDNO.14所示的FR2，SEQIDNO.15所示的FR3，SEQIDNO.8所示的FR4；或SEQIDNO.5所示的氨基酸序列FR1，SEQIDNO.14所示的FR2，SEQIDNO.16所示的FR3，SEQIDNO.8所示的FR4；所述的互补决定区CDR选自以下的CDR1～CDR3的氨基酸序列：SEQIDNO.17所示的CDR1，SEQIDNO.18所示的CDR2，SEQIDNO.19所示的CDR3；或SEQIDNO.20所示的CDR1，SEQIDNO.21所示的CDR2，SEQIDNO.22所示的CDR3；或SEQIDNO.17所示的CDR1，SEQIDNO.23所示的CDR2，SEQIDNO.24所示的CDR3；或SEQIDNO.25所示的CDR1，SEQIDNO.26所示的CDR2，SEQIDNO.27所示的CDR3；或SEQIDNO.28所示的CDR1，SEQIDNO.29所示的CDR2，SEQIDNO.22所示的CDR3；或SEQIDNO.30所示的CDR1，SEQIDNO.31所示的CDR2，SEQIDNO.22所示的CDR3。优选地，它具有SEQIDNO.32、SEQIDNO.33、SEQIDNO.34、SEQIDNO.35、SEQIDNO.36或SEQIDNO.37所示的氨基酸序列。本专利技术第二方面，一种人CD7纳米抗体，它是针对人CD7分子表位的的纳米抗体，包括具有SEQIDNO.32、SEQIDNO.33、SEQIDNO.34、SEQIDNO.35、SEQIDNO.36或SEQIDNO.37所示的氨基酸序列的VHH链。本专利技术第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：权利要求1或2所示的人CD7纳米抗体的VHH链，或权利要求3所示的人CD7纳米抗体。优选地，所述的DNA分子,它具有选自下组的DNA序列：SEQIDNO.38、SEQIDNO.39、SEQIDNO.40、SEQIDNO.41、SEQIDNO.42或SEQIDNO.43。本专利技术的第四方面，提供了—种表达载体,其特征在于,它含SEQIDNO.38、SEQIDNO.39、SEQIDNO.40、SEQIDNO.41、SEQIDNO.42或SEQIDNO.43所示的核苷酸序列。本专利技术的第五方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于，它表达针对人CD7的纳米抗体。本专利技术的第六方面，提供了本专利技术所述的人CD7纳米抗体用于检测人CD7分子的用途。本专利技术的第七方面，提供了本专利技术所述的人CD7纳米抗体用于流式检测和细胞免疫荧光实验的用途。有益效果：(1)本专利技术首先用流式检测方法，选择高表达人CD7分子的癌细胞系，经处理后使其具有免疫原性，然后用该细胞系免疫骆驼，取骆驼外周血提取淋巴细胞制备纳米抗体免疫基因库，最后在人肾上皮细胞系(293Tcellline)上进行筛选CD7纳米抗体，从而获得了人CD7特异性的纳米抗体基因。将此基因克隆至原核表达载体并转化到大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。(2)本专利技术使用高表达目的抗原的细胞免疫骆驼，获得的免疫库比较丰富，除了可以筛选目的抗原抗体，同时在所免疫细胞上的其它高表达分子同样可以拿来被筛选，比用多肽或者蛋白作为抗原一次免疫只能产生一种类型的针对所选抗原的抗体更能够节约成本、时间以及人力；(3)本专利技术使用细胞来对制备的纳米抗体库进行淘筛人CD7分子纳米抗体，能够获得特异性识别天然活性的人CD7分子，这种特异性的纳米抗体可以被拿来用于流式检测和细胞免疫荧光实验。附图说明图1是第一轮PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，切胶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人CD7纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征在于，所述框架区FR选自以下的FR1～FR4的氨基酸序列：SEQIDNO.1所示的FR1，SEQIDNO.2所示的FR2，SEQIDNO.3所示的FR3，SEQIDNO.4所示的FR4；或SEQIDNO.5所示的FR1，SEQIDNO.6所示的FR2，SEQIDNO.7所示的FR3，SEQIDNO.8所示的FR4；或SEQIDNO.1所示的氨基酸序列FR1，SEQIDNO.9所示的FR2，SEQIDNO.3所示的FR3，SEQIDNO.4所示的FR4；SEQIDNO.5所示的FR1，SEQIDNO.10所示的FR2，SEQIDNO.11所示的FR3，SEQIDNO.12所示的FR4；或SEQIDNO.13所示的FR1，SEQIDNO.14所示的FR2，SEQIDNO.15所示的FR3，SEQIDNO.8所示的FR4；或SEQIDNO.5所示的氨基酸序列FR1，SEQIDNO.14所示的FR2，SEQIDNO.16所示的FR3，SEQIDNO.8所示的FR4；所述的互补决定区CDR选自以下的CDR1～CDR3的氨基酸序列：SEQIDNO.17所示的CDR1，SEQIDNO.18所示的CDR2，SEQIDNO.19所示的CDR3；或SEQIDNO.20所示的CDR1，SEQIDNO.21所示的CDR2，SEQIDNO.22所示的CDR3；或SEQIDNO.17所示的CDR1，SEQIDNO.23所示的CDR2，SEQIDNO.24所示的CDR3；或SEQIDNO.25所示的CDR1，SEQIDNO.26所示的CDR2，SEQIDNO.27所示的CDR3；或SEQIDNO.28所示的CDR1，SEQIDNO.29所示的CDR2，SEQIDNO.22所示的CDR3；或SEQIDNO.30所示的CDR1，SEQIDNO.31所示的CDR2，SEQIDNO.22所示的CDR3。...

【技术特征摘要】
1.一种人CD7纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，其特征在于，所述框架区FR是选自以下(a)－(f)所构成的组的FR1～FR4的氨基酸序列所构成的框架区FR：(a)SEQIDNO.1所示的FR1，SEQIDNO.2所示的FR2，SEQIDNO.3所示的FR3，和SEQIDNO.4所示的FR4；(b)SEQIDNO.5所示的FR1，SEQIDNO.6所示的FR2，SEQIDNO.7所示的FR3，和SEQIDNO.8所示的FR4；(c)SEQIDNO.1所示的FR1，SEQIDNO.9所示的FR2，SEQIDNO.3所示的FR3，和SEQIDNO.4所示的FR4；(d)SEQIDNO.5所示的FR1，SEQIDNO.10所示的FR2，SEQIDNO.11所示的FR3，和SEQIDNO.12所示的FR4；(e)SEQIDNO.13所示的FR1，SEQIDNO.14所示的FR2，SEQIDNO.15所示的FR3，和SEQIDNO.8所示的FR4；(f)SEQIDNO.5所示的FR1，SEQIDNO.14所示的FR2，SEQIDNO.16所示的FR3，和SEQIDNO.8所示的FR4；并且所述的互补决定区CDR是选自以下(i)－(vi)所构成的组的CDR1～CDR3的氨基酸序列所构成的互补决定区CDR：(i)SEQIDNO.17所示的CDR1，SEQIDNO.18所示的CDR2，和SEQIDNO.19所示的CDR3；(ii)SEQIDNO.20所示的CDR1，SEQIDNO.21所示的CDR2，和SEQIDNO.22所示的CDR3；(iii)SEQIDNO.17所示的CDR1，SEQIDNO.23所示的CDR2，和SEQIDNO.24所示的CDR3；(iv)SEQIDNO.25所示的CDR1，SEQIDNO.26所示的CDR2，和SEQIDNO.27所示的CDR3；(v)SEQIDNO.28所示的CDR1，SEQIDNO.29所示的CDR2，和SEQIDNO.22所示的CDR3；(vi)SEQIDNO.30所示的CDR1，SEQIDNO.31所示的CDR2，和SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤金乐，杨林，
申请(专利权)人：博生吉医药科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32