用于香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷的生物合成的组合物和方法技术

本发明专利技术公开了已被工程化改造以单独地或与一种或多种香草醛生物合成酶类或UDP-糖基转移酶（UGT）组合地表达突变体AROM多肽和/或突变体儿茶酚-O-甲基转移酶多肽的重组微生物、植物和植物细胞。这样的微生物、植物或植物细胞可以生产香草醛或香草醛β-D-葡萄糖苷。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术简介本申请要求分别提交于2011年8月8日和2011年8月10日的美国临时申请号61/521，090和61/522，096的优先权利益，所述临时申请的内容整体通过参考并入本文。
技术介绍
香草醛是世界上最重要的香料化合物之一，全球市场为1.8亿美元。天然的香草醛源自于香草兰(扁叶香果兰(Vanilla planifolia))的熟化种荚，但是世界上大多数的香草醛从石化产品或木浆木质素合成。从香草豆荚生产天然香草醛是费力且缓慢的过程，其需要对花进行手工授粉和将收获到的绿色香草豆荚熟化1-6个月(Ramachandra&Ravishankar (2000)J.Sc1.Food Agric.80:289-304)。生产 I 千克(kg)香草醛需要大约500kg香草豆荚，对应于授粉大约40，000朵花。目前，每年销售的香草醛中仅有约0.25% (16，000吨中的40吨)源自于香草豆荚，而其余的大多数从木质素或化石烃类、尤其是愈创木酚化学合成。合成生产的香草醛售价约为每千克$15，与此相比天然香草醛的价格为每千克 $1200-4000 (Walton 等，(2003) Phytochemistry63:505-515)。专利技术概述本专利技术提供了用于生产香草醛和/或香草醛β-D-葡萄糖苷的方法。本专利技术的方法包括下列步骤:(a)提供能够生产香草醛的重组宿主，其中所述重组宿主带有编码突变体Arom多功能酶(AROM)多肽和/或突变体儿茶酚_0_甲基转移酶(COMT)多肽的异源核酸；(b)将所述重组宿主培养足以使所述重组宿主产生香草醛和/或香草醛葡萄糖苷的时间；以及(c)从所述重组宿主或从所述培养上清液分离香草醛和/或香草醛葡萄糖苷，由此生产香草醛和/或香草醛β -D-葡萄糖苷。在一种实施方式中，提供了突变体AROM多肽，其中所述突变体相对于缺少所述突变的相应AROM多肽具有降低的莽草酸脱氢酶活性。根据这种实施方式，所述突变体AROM多肽可以在结构域5中具有一个或多个突变、缺失结构域5的至少一部分或缺少结构域5。在另一种实施方式中，所述突变体AROM多肽是融合多肽，其包括(i )本文描述的AROM多肽，例如，包含缺失结构域5的至少一部分的AROM多肽、或缺少结构域5的AROM多肽；以及(ii)具有3-脱氢莽草酸脱水酶(3DSD)活性的多肽。在其他实施方式中，提供了突变体COMT多肽，其中所述突变体具有一种或多种改进的性质。具体来说，本专利技术提供了倾向于在原儿茶酸和/或原儿茶醛和/或原儿茶醇的间位而不是对位处催化甲基化的突变体COMT多肽。本文描述的任何多肽还可以在所述多肽的N-端或C-端包括纯化标签、叶绿体转运肽、线粒体转运肽、造粉体肽、信号肽或分泌标签。 在某些实施方式中，所述宿主可以是微生物，例如酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)或大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)。或者,所述宿主可以是植物或植物细胞(例如小立碗藓属(Physcomitrella)植物或植物细胞、或烟草植物或植物细胞)。本文描述的任何宿主还可以包含编码芳香族羧酸还原酶(ACAR)、3-脱氢莽草酸脱水酶(3DSD)、尿苷5’ - 二磷酸葡萄糖基转移酶(UGT)、磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase )、野生型AROM和/或野生型O-甲基转移酶(OMT)的基因。还提供了编码突变体COMT多肽或突变体AROM多肽的分离的核酸。附图简述图1是香草醛(4)的从头生物合成的示意图，以及在表达3DSD、ACAR、OMT和UGT以及磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase)的生物体中发现的不同的香草醛降解产物和代谢副产物，即脱氢莽草酸(I)、原」L茶酸(2 )、原儿茶醛(3 )、香草酸(5 )、原儿茶醇(6 )，香草醇(7)和香草醛β-D-葡萄糖苷(8)的概述。空心箭头示出了酵母中的主要代谢反应；黑色箭头示出了通过代谢工程引入的酶反应；对角条纹箭头示出了酵母固有的不想要的代谢反应。图2是使用野生型AROM多肽(左侧)和缺少结构域5的突变体AROM多肽(右侧)细胞生物合成芳香族氨基酸酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的示意图。图3Α示出了在表达各种突变体COMT多肽的酵母菌株中香草醛(VG)和异香草醛(IsoVg)的生产。图3Β和图3C示出 了与人类OMT (Hs-OMT)和人类L198Y OMT突变体(HS-0MTL198Y)相比，从各种来源分离的COMT多肽的香草醛(VG)和异香草醛(IsoVg)生产。致病疫霉(Phytophthera infestans) (PI),长春花(Catharanthus roseus) (CR),解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) (YL),玻璃海鞘(Ciona intestinalis) GENBANK 登记号XP_002121420 和 XP_002131313 (C1-1 和 C1-2)，Capsasproa owczarzaki (CO)，嗜热毛壳菌(Chaetomium therophilum) (CT),卢西坦棒抱酵母(Clavispora Iusitaniae (CL),副球抱子菌属物种(Paracoccidioides sp) ‘lutzii’ PbOl (PL),扁叶香果兰(Vanillaplanifolia) (VP),阿拉比卡咖啡树(Coffea Arabica) (CA),大鼠(Rattus norvegicus)(RN),小鼠(Mus musculus) (MM),泉古菌(Crenarchaeote) (CREN), Mycobacteriumvanbaleeni (MV),或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) (SP)0图4不出了在增补有3mM香草醇的表达简青霉(Penicillium simplicissium)(PS)或Rhodococcus jostii (RJ)香草醇氧化酶(VAO)的酵母菌株中香草醒葡萄糖苷、香草醛、香草醇葡萄糖苷和香草醇的水平。图5示出了在增补有3mM香草酸的培养基中生长的表达N.1owensis ACAR或粗糙脉孢霉(N.crassa) ACAR和大肠杆菌磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase)或粟酒裂殖酵母(S.pombe) PPTase的酵母菌株中香草酸、香草醒和香草醒葡萄糖苷的水平。专利技术详述本专利技术是基于下述发现，即突变体AROM多肽可用于在重组宿主中提高3-脱氢莽草酸(3-DHS)积累。3-DHS是香草醛生物合成的前体，并且如果更多的细胞内3-DHS可用，则在香草醛生物合成途径的第一个关键步骤中可以制造更多的原儿茶酸。参见图1。在酵母中，AROM是由AROl基因编码的五功能酶复合物。所述基因长为4764bp，并编码长度为1588个氨基酸的相应多肽。AROM执行5个连续的酶促转化，即将DAHP (3-脱氧-D-阿拉伯糖基-庚酮糖酸-7-磷酸)转变成3-DHQ (3-脱氢奎尼酸)，其被转变成3-DHS (3-脱氢莽草酸)，其被转变成莽草酸，其被转变成莽草酸-3-P (莽草酸3-磷酸)，其被转变成EP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于生产香草醛和/或香草醛β‑D‑葡萄糖苷的方法，所述方法包括：（a）提供能够生产香草醛的重组宿主，其中所述重组宿主带有编码突变体Arom多功能酶（AROM）多肽和/或突变体儿茶酚‑O‑甲基转移酶（COMT）多肽的异源核酸；（b）将所述重组宿主培养足以使所述重组宿主产生香草醛和/或香草醛葡萄糖苷的时间；以及（c）从所述重组宿主或从所述培养上清液分离香草醛和/或香草醛葡萄糖苷，由此生产香草醛和/或香草醛β‑D‑葡萄糖苷。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.08.08 US 61/521,090;2011.08.10 US 61/522,0961.一种用于生产香草醒和/或香草醒β -D-葡萄糖苷的方法,所述方法包括: Ca)提供能够生产香草醛的重组宿主，其中所述重组宿主带有编码突变体Arom多功能酶(AROM)多肽和/或突变体儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)多肽的异源核酸； (b)将所述重组宿主培养足以使所述重组宿主产生香草醛和/或香草醛葡萄糖苷的时间；以及 (c)从所述重组宿主或从所述培养上清液分离香草醛和/或香草醛葡萄糖苷，由此生产香草醛和/或香草醛β -D-葡萄糖苷。2.权利要求1的方法，其中所述突变体AROM多肽相对于野生型AROM多肽表现出降低的莽草酸脱氢酶活性。3.权利要求1或2的方法，其中所述突变体AROM多肽包含下述突变中的一个或多个: (a)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1349位置对齐的位置处，缬氨酸之外的氨基酸；(b)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1366位置对齐的位置处，苏氨酸之外的氨基酸；(c)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1370位置对齐的位置处，赖氨酸之外的氨基酸； (d)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1387位置对齐的位置处，异亮氨酸之外的氨基酸；(e)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1392位置对齐的位置处，苏氨酸之外的氨基酸；(f)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1441位置对齐的位置处，丙氨酸之外的氨基酸；(g)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1458位置对齐的位置处，精氨酸之外的氨基酸；(h)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1500位置对齐的位置处，脯氨酸之外的氨基酸； (i)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1533位置对齐的位置处，丙氨酸之外的氨基酸；以及 (j)在与SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的1571位置对齐的位置处，色氨酸之外的氨基酸。4.权利要求1或2的方法，其中所述突变体AROM多肽包含下述突变中的一个或多个:(a)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1349位置对齐的位置处的甘氨酸残基；(b)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1366位置对齐的位置处的甘氨酸残基；(c)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1370位置对齐的位置处的亮氨酸残基；(d)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1387位置对齐的位置处的组氨酸残基；(e)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1392位置对齐的位置处的赖氨酸残基；(f)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1441位置对齐的位置处的脯氨酸残基；(g)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1458位置对齐的位置处的色氨酸残基；(h)在与SEQID NO:4中显示的氨基酸序列的1500位置对齐的位置处的赖氨酸残基；(i)在与SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的1533位置对齐的位置处的脯氨酸残基；以及 (j)在与SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的1571位置对齐的位置处的缬氨酸残基。5.权利要求1或2的方法，其中所述突变体AROM多肽缺失结构域5的至少一部分。6.权利要求1、2或5的方法，其中所述突变体AROM多肽缺少结构域5。7.权利要求1、2、5或6的方法，其中所述突变体AROM多肽是融合多肽，其包含: (i)缺失结构域5的至少一部分；并且 (ii)具有3-脱氢莽草酸脱水酶(3DSD)活性。8.权利要求1的方法，其中所述突变体COMT多肽能够催化原儿茶酸的-OH基团的甲基化，其中所述甲基化导致产生与异香草酸相比至少4倍多的香草酸。9.权利要求1或8的方法，其中所述突变体COMT多肽具有在SEQID NO:27的整个长度上确定的与SEQ ID NO:27享有至少80%序列同一性的氨基酸序列；并且其具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:27的差别为至少一个氨基酸残基。10.权利要求1、8或9的方法，其中所述突变体COMT多肽在SEQID NO:27中显示的氨基酸序列中包含I至10个氨基酸置换。11.权利要求1、8、9或10的方法，其中所述突变体COMT多肽在SEQID NO:27的198位置处包含具有比亮氨酸更低的亲水指数的氨基酸。12.权利要求1、8、9、10或11的方法，其中所述突变体COMT多肽在SEQID NO:27的198位置处包含 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Glu、Gin、Gly、His、Lys> Met> Phe> Pro、Ser> Thr>Trp 和 Tyr。13.权利要求1或8-12的方法，其中所述突变体COMT多肽在SEQID NO:27的199位置处包含在PH7.4下具有中性或正的侧链电荷的氨基酸。14.权利要求1或8-13的方法，其中所述突变体COMT多肽在SEQID NO:27的199位置处包含 Ala、Arg、Asn、Cys> Gin、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr> Trp>Tyr 和 Val。15.前述权利要求任一项的方法，其中所述突变体AROM多肽或突变体COMT多肽还在所述多肽的N-端或C-端包含纯化标签、叶绿体转运肽、线粒体转运肽、造粉体肽、信号肽或分泌标签。16.前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主是微生物。17.前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)或大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)。18.前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主是包含pdcl缺失、gdhl缺失并且过表达谷氨酸脱氢酶2 (GHD2)的酿酒酵母(S.cerevisiae)。19.权利要求1-15任一项的方法，其中所述宿主是植物或植物细胞。20.权利要求1-15或19任一项的方法，其中所述宿主是小立碗藓属(Physcomitrella)植物或植物细胞、或烟草植物或植物细胞。21.前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主还包含编码3-脱氢莽草酸脱水酶(3DSD)的基因、编码芳香族羧酸还原酶(ACAR)的基因、编码尿苷5’ - 二磷酸葡萄糖基转移酶(UGT)的基因、编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase)的基因和/或编码香草醇氧化酶(VAO)的基因。22.前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主带有编码突变体COMT多肽的异源核酸，并且还包含编码野生型AROM多肽的基因。23.权利要求1-21任一项的方法，其中所述宿主带有编码突变体AROM多肽的异源核酸，并且还包含编码野生型O-甲基转移酶(OMT)的基因。24.一种提取物，其包含通过前述...

【专利技术属性】
技术研发人员：于尔根·汉森，埃斯本·哈尔克耶尔·汉森，霍尼·泊卢尔，约瑟夫·M·谢里登，乔纳森·R·希尔，威廉·DO·汉密尔顿，
申请(专利权)人：国际香料香精公司，伊沃华公司，
类型：发明
国别省市：美国;US