本发明专利技术公开了一种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针及其制备方法和用途，该探针基于多个金纳米颗粒聚集导致吸光值变化。该探针主要有两大部分组成，其一为生物功能化的磁珠纳米微球颗粒，其二为金纳米颗粒复合溶液，其特征为含有检测抗体(Ab2)或核酸适配体及具有生物酶活性物质表面修饰的磁珠纳米颗粒和可被上述酶催化的底物及金纳米颗粒。该超高灵敏度探针能与疾病生物标识物高效识别，附着于磁珠纳米微球颗粒表面的具有生物酶活性物质可以将其可催化的底物降解为带正电的产物，引起多个金纳米颗粒的聚集，从而导致金纳米颗粒溶液吸光值的变化。本发明专利技术方法大大提高了疾病生物标识物的检测灵敏度，并同时具有设备简易、操作简单、且能批量检测的优点。
【技术实现步骤摘要】
一种用于疾病标志物或病原体检测的超局灵敏度?米针及其制备方法和用途
[0001 ] 本专利技术涉及一种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，其制备方法及所属纳米材料用于肿瘤等疾病生物标识物、或其他疾病病原体检测应用，属于生物医学工程以及纳米医学领域。
技术介绍
在疾病体外诊断方面，高特异性、高灵敏度和高通量特性的检测技术是人们一直追求的目标。新的快速检测方法的建立，简化了操作流程，降低检测成本，提高了检测的时效性和准确性。人们利用病原体的快速检出技术可以掌握传染病的流行状况，这对及早做出正确的临床决策意义重大，然而目前在临床生物标志物检测上广泛应用的方法是酶联免疫吸附法(以下简称ELISA)，由于其中等程度的敏感性，只有生物标志物的水平已经达到临界阈值浓度后才能检测，限制了其用于疾病早期检测应用。再者，基于聚合酶链式反应(PCR)的检测技术在近几年层出不穷，虽然PCR技术有着超高的灵敏度，然而同时，该技术需要昂贵的实验设备、试剂和技术工人，这些因素大大限制了其广泛应用，尤其是在偏远地区如发展中国家。因此临床上对于可替代PCR技术的超高灵敏检测方法的需求尤为紧迫。正如20世纪70年代的微米技术一样，纳米技术将成为21世纪的主导技术，为生物诊疗领域的发展提供了很大空间。目前光、磁和电响应纳米粒子已经广泛应用于纳米医学、分子影像学等领域。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供一种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针；本专利技术的另一目的在于提供一种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针的制备方法；本专利技术的再一目的是提供一种利用所述的超高灵敏度探针作为疾病标识物或病原体检测系统的应用。本专利技术的目的可以通过如下技术方案实现:—种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，其特征为含有检测抗体或核酸适配体及具有生物酶活性物质表面修饰的磁珠纳米粒子(0.lmg/ml-5mg/ml,更优选的较窄范围为0.lmg/ml-1.2mg/ml)，和可被上述酶催化的底物(0.1 μ M-100 μ M，更优选的较窄范围为10μΜ-50μΜ)，及金纳米颗粒溶液(ΙηΜ-ΙΟΟηΜ，更优选的较窄范围为InM-1OnM)。其中，所述的磁珠纳米微球颗粒包括磁性纳米颗粒、碳纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、乳胶体纳米颗粒、陶瓷纳米颗粒、聚合物纳米颗粒。本专利技术优选采用磁珠纳米微球颗粒。其中，所述的金纳米颗粒包括金纳米粒子、金纳米棒、金纳米星、金纳米囊,金纳米笼或金纳米壳中的至少一种。其中，所述的抗体或核酸适配体，为一种或多种检测抗体或核酸适配体，其根据检测靶标物质而定。所述的抗体，其为鼠源或人源或羊源或其它动物来源，或为基因工程抗体，如人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体或单链抗体等。本专利技术优选鼠源单克隆抗体。其中，所述的将具有酶活性功能的物质与纳米微球颗粒通过化学偶联的方式进行结合，所述偶联可以是炔烃-叠氮法、MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法等。本专利技术优选采用活泼酯法。其中，所述的具有酶活性物质包括羧酸酯酶类、硫酯酶类、磷酸单酯酶类磷、磷酸二酯酶类、硫磷酸酯酶等。本专利技术优选采用乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,以下称AChE)。其中，所述的可以被具有酶活性物质所催化的底物包括羧酸酯类、硫酯类、磷酸单酯类、磷酸二酯类、硫磷酸酯类等。本专利技术优选采用硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholine)。其中，将抗体或核酸适配体与具有酶活性物质通过化学偶联的方式进行结合，所述偶联可以是炔烃-叠氮法、MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法等，本专利技术优选采用炔烃-叠氮法、活泼酯法。用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针制备方法，包括I)磁珠纳米微球颗粒溶液中加入过量的酶活性物质，反应0.5-3小时后，分离去除过量的酶活性物质。后加入可发生化学偶联的基团。2)将检测抗体或核酸适配体加入化学偶联基团，该基团可与I)中的基团反应。室温下反应0.5-3小时,利用离心方法去除未结合的基团。3)将I)与2)分别得到的产物混合，得到生物功能化的磁珠纳米微球颗粒。4)混有可被酶活性物质催化的相关底物和金纳米颗粒溶液混合，即得到金纳米颗粒复合溶液。5)生物功能化的磁珠纳米微球颗粒和金纳米颗粒复合溶液即组成了用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针。更佳地，该用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针的制备方法，包括以下步骤:I)取 100 μ L NHS (N-hydroxys μ ccinimide)活化的磁珠纳米颗粒(10mg/mL)于小离心管中，借助于磁力架，用盐酸(lmM，4°C )清洗一遍。后加入100 μ L溶解于PBS中的乙酰胆碱酯酶(lmg/mL)，涡旋混匀30秒。后将该混合物置于振荡器中反应2小时，反应条件为室温。在开始的30分钟，每隔5分钟将小离心管涡旋振荡15秒。剩余的90分钟，每15分钟将小离心管涡旋振荡15秒，从而得到结合了乙酰胆碱酯酶的磁珠纳米颗粒。后加入5 μ LNHS活化的叠氮基团(ImM)，室温反应30分钟，从而得到偶联了叠氮基和乙酰胆碱酯酶的磁珠纳米颗粒。2)取ImL检测抗体(lmg/mL)，抗体缓冲环境为PBS (pH = 7.4)，取33 μ LNHS活化的DBCO(dibenzocyclooctyl, IOmM)加入到抗体中，DBCO与抗体的摩尔比为50:1。室温反应30分钟后，加入IMTris-HCl (pH = 8.0)以终止反应，Tris终浓度为50mM，终止反应持续5分钟。即得到偶联了 DBCO的抗体溶液。3)取10 μ L偶联了 DBCO的抗体溶液(lmg/mL)加入到ImL偶联了叠氮基和乙酰胆碱酯酶的磁珠纳米颗粒(lmg/mL)中，室温反应2小时，即得到了偶联了抗体和乙酰胆碱酯酶的磁珠纳米颗粒。4)硫代乙酰胆碱(20 μ M)和金纳米颗粒(15nm,2.3ηΜ)的混合物即为金纳米颗粒复合溶液。本专利技术研制出一种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针及其制备方法。该探针主要有两大部分组成，其一为生物功能化的磁珠纳米微球颗粒，其二为金纳米颗粒复合溶液，其特征为含有检测抗体或核酸适配体及具有生物酶活性物质表面修饰的磁珠纳米粒子和可被上述酶催化的底物及金纳米颗粒。用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针能与疾病标识物或病原体高效识别，附着于磁珠纳米微球颗粒表面的具有生物酶活性物质可以将其可催化的底物降解为带正电的产物，该产物可以引起金纳米颗粒的聚集，从而导致金纳米颗粒溶液吸光值的变化。吸光值变化的程度与样品中的生物标识物的浓度成比例。并且吸光值的变化肉眼可见。磁珠纳米颗粒具有较高的惰性，苛刻的环境对其影响小，同时其具有较强的人工可修饰性，在其表面修饰一定的化学基团，从而可以进一步偶联生物活性物质，对其进行功能性改造。磁珠纳米颗粒还具有较大的体表面积，每个磁珠颗粒上可以附着巨大数量的生物活性物质，从而起到信号放大的作用，实现对较低含量靶标物质的检出。在金纳米颗粒溶液中，金纳米颗粒表面附着一层柠檬酸盐，表面带有均匀的负电荷，是金纳米颗粒均匀地分布在溶液中。当有打破这一电荷平衡的物质(带正电荷的物质如巯基基团)出现时本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，其特征在于，所述的探针包括检测抗体或核酸适配体及0.5mg/ml‑5mg/ml具有生物酶活性物质表面修饰的磁珠纳米颗粒，和0.1mM‑100mM可被上述酶催化的底物，及1nM‑100nM金纳米颗粒溶液；或所述的探针不包括磁珠纳米颗粒，即该探针仅包括检测抗体或核酸适配体及具有生物酶活性物质，和0.1mM‑100mM可被上述酶催化的底物，及1nM‑100nM金纳米颗粒溶液。
【技术特征摘要】
1.一种用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，其特征在于，所述的探针包括检测抗体或核酸适配体及0.5mg/ml-5mg/ml具有生物酶活性物质表面修饰的磁珠纳米颗粒,和0.1mM-1OOmM可被上述酶催化的底物,及InM-1OOnM金纳米颗粒溶液；或所述的探针不包括磁珠纳米颗粒，即该探针仅包括检测抗体或核酸适配体及具有生物酶活性物质，和0.1mM-1OOmM可被上述酶催化的底物，及InM-1OOnM金纳米颗粒溶液。2.如权利要求1所述的用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，其特征在于，所述的磁珠纳米微球颗粒包括磁性纳米颗粒、碳纳米颗粒、二氧化娃纳米颗粒、乳胶体纳米颗粒、陶瓷纳米颗粒或聚合物纳米颗粒中的至少一种。3.如权利要求1所述的用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，其特征在于，所述的具有酶活性物质包括羧酸酯酶类、硫酯酶类、磷酸单酯酶类磷、磷酸二酯酶类、硫磷酸酯酶、乙酰胆碱酯酶中的至少一种。4.如权利要求1所述的用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，其特征在于，所述的抗体或核酸适配体，为一种或多种检测抗体或核酸适配体。5.如权利要求3所述的用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，其特征在于，可被权利要求3中酶活性物质催化的底物，包括羧酸酯类、硫酯类、磷酸单酯类、磷酸二酷类或硫憐Ife酷。6.如权利要求1所述的用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，其特征在于，将具有酶活性功能的物质与纳米微球颗粒通过化学偶联的方式进行结合，所述偶联包括炔烃-叠氮法、MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代硝基苯法及亚胺酸脂法。7.如权利要求1所述的用于疾病标志物或病原体检测的超高灵敏度探针，其特征在于，将抗体或核酸适配体与具有酶活性物质通过化学偶联的方式进行结合，所述偶联包括炔烃-叠氮法、MBS法、戊二醛法、活泼酯...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘刚，陈小元，刘定斌，王占通，杨彩霞，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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