一种泰乐菌素产生菌、遗传改造方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种泰乐菌素产生菌、遗传改造方法及其应用。通过对泰乐菌素生物合成基因簇中碳霉糖合成基因簇(包含tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV及tylCII)的同框敲除，获得可以直接生产替米考星的合成前体—泰乐菌素B(Tb)的菌株。本发明专利技术的泰乐菌素产生菌可直接发酵生产替米考星的合成前体，简化替米考星的合成工艺。

【技术实现步骤摘要】
一种泰乐菌素产生菌、遗传改造方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体地，本专利技术涉及一种泰乐菌素产生菌、遗传改造方法及其应用，本专利技术还涉及一种直接发酵生产替米考星合成前体泰乐菌素B的方法。
技术介绍
禽类呼吸道感染诱发的疾病是当今危害畜牧业发展的主要原因之一，目前用于防治此类疾病的有效药物很少，主要是采用大环内酯类药物泰乐菌素。泰乐菌素(Tylosin)，又名泰乐星、泰洛霉素，是一类十六元环大环内酯类抗生素。美国礼来公司于1962年开发并成功推向市场，迄今为止已工业化生产40多年，是一类极其重要的禽畜专用抗生素，它广泛用作饲料添加剂和动物治疗,能明显促进禽畜生长,并提高饲料的利用率。泰乐菌素的作用原理是，它通过与核糖体50S亚基结合从而选择性地阻断原核生物蛋白质的合成，是一类广谱低毒的抗生素。由于存在耐药性的问题，以及近年来发现其在禽畜体内有药物残留，再加之其与红霉素等人用大环内酯类抗生素的结构具有很大的相似性，欧盟委员会1999年正式作出决议，禁止将泰乐菌素作为“动物生长促进剂”用作饲料添加剂。20世纪80年代，英国Elanco动物保健品公司开发了以泰乐菌素为前体半合成的大环内酯类禽畜用抗生素-替米考星(Tilmicosin)，替米考星抗菌作用与泰乐菌素相似，主要抗革兰氏阳性菌和支原体，对少数革兰氏阴性菌也有效，然而其对胸膜肺炎放线杆菌、畜禽支原体和巴氏杆菌的活性比泰乐菌素强。与泰乐菌素相比，替米考星具有与其类似的分子结构和更优化、更广的抗菌谱，并且与临床常用的其它抗生素之间无交叉抗药性，因此具有较高的实际应用价值。替米考星已被美国FDA批准临床使用于治疗牛、山羊、绵羊、奶牛、猪、鸡等动物由敏感菌引起的传染性疾病，特别是禽畜的呼吸道感染疾病。目前替米考星的传统生产是将泰乐菌素产生菌进行发酵，发酵产物中的泰乐菌素包括泰乐菌素Ａ(Ta)和泰乐菌素Ｂ(Tb)。通过水解泰乐菌素A(Ta)，获得泰乐菌素B(Tb)(见图1)，然后泰乐菌素B通过胺化作用连接上一个3’5’-二甲基哌啶基，从而形成终产物替米考星。采用敲除碳霉糖糖基转移酶tylCV的方法获得了以泰乐菌素B产量上升的工程菌株，然而仍有一定量的泰乐菌素A产生，并且由于从发酵产物中提取泰乐菌素B的流程十分繁琐，产物得率很低，因此在很大程度上限制了泰乐菌素B的应用。因此本领域迫切需要对泰乐菌素生产菌进行改造，开发适用于大规模工业生产的泰乐菌素B的工艺方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种泰乐菌素产生菌及其应用。本专利技术的另一目的是提供一种新型泰乐菌素产生菌的遗传改造方法及其用途。在本专利技术的第一方面，提供了一种泰乐菌素产生菌，所述的产生菌的发酵产物中，泰乐菌素B(Tb)的相对含量满足下式：B/(A+B)≥95%式中，B为发酵产物中泰乐菌素B(Tb)的质量；A为发酵产物中泰乐菌素A(Ta)的质量。在另一优选例中，泰乐菌素B(Tb)的相对含量≥96%，更佳地≥99%，最佳地≥99.5%。在另一优选例中，所述泰乐菌素产生菌为链霉菌属。在另一优选例中，所述泰乐菌素产生菌为弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)SWL00020，保藏编号为：CGMCCNo.6717。在另一优选例中，所述产生菌的基因组中碳霉糖合成基因簇被失活或敲除。在另一优选例中，所述产生菌中缺失以下5种基因：tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV和tylCII。在另一优选例中，所述产生菌不表达以下5种基因：tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV及tylCII。在另一优选例中，所述基因簇的序列如SEQIDNO：1所示。在本专利技术的第二方面，提供了一种第一方面所述的泰乐菌素产生菌的用途，它被用做发酵生产泰乐菌素B(Tb)的工程菌株。在本专利技术的第三方面，提供了一种生产泰乐菌素B(Tb)的方法，包括步骤：(a)培养第一方面所述的泰乐菌素产生菌，从而产生含有泰乐菌素B的发酵产物；和(b)从发酵产物中分离出泰乐菌素B(Tb)。在本专利技术的第四方面，提供了一种生产替米考星的方法，(a)培养第一方面所述的泰乐菌素产生菌，从而产生含有泰乐菌素B的发酵产物；(b)从发酵产物中分离出泰乐菌素B(Tb)；和(c)将分离出的泰乐菌素B(Tb)转化为替米考星。在另一优选例中，步骤(c)所述转化是将泰乐菌素B(Tb)与3’5’一二甲基哌啶基进行胺化作用，形成替米考星。在本专利技术的第五方面，提供了一种制备泰乐菌素产生菌的方法，包括步骤：(1)构建用于同源重组的载体，所述的载体依次含有以下元件：碳霉糖合成基因簇上游同源臂序列，连接序列，和碳霉糖合成基因簇下游的同源臂序列；(2)将步骤(1)的所述载体导入出发菌株，获得导入载体的菌株，其中所述的出发菌株可发酵产生泰乐菌素A和泰乐菌素B；(3)从步骤(2)获得的导入载体的菌株中，筛选所述上游同源臂序列和下游同源臂序列与出发菌株的基因组发生了二次同源重组的菌株，从而获得泰乐菌素产生菌。在另一优选例中，步骤(3)之后还包括步骤(4)：验证泰乐菌素产生菌是否缺失碳酶糖合成基因簇。在另一优选例中，步骤(1)所述的连接序列为0-200bp长度碱基序列。在另一优选例中，步骤(1)所述同源臂序列是用PCR扩增的方法获得的。在另一优选例中，步骤(1)所述同源臂序列的长度没有特别限制，较佳地≥15000bp。在另一优选例中，步骤(1)所述载体为穿梭质粒，较佳地为大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒。在另一优选例中，步骤(1)所述载体还含有抗生素抗性基因，较佳地为阿泊拉霉素抗性基因。在另一优选例中，步骤(2)所述的导入方法为接合转移导入法。在另一优选例中，步骤(2)所述的出发菌株为链霉菌属，较佳地为弗氏链霉菌，更佳地为弗氏链霉菌NRRL2702。在另一优选例中，步骤(3)所述的基因组与载体发生二次同源重组的菌株为失去阿泊拉抗性的二次同源重组的菌株。在另一优选例中，所述碳霉糖合成基因簇包含基因tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV及tylCI。在另一优选例中，所述碳霉糖合成基因簇的序列如SEQIDNO：1所示。在本专利技术的第六方面，提供了一种用于同源重组的载体，所述载体依次含有以下元件：碳霉糖合成基因簇上游同源臂序列，连接序列，和碳霉糖合成基因簇下游的同源臂序列，且所述载体缺失碳霉糖合成基因簇。在另一优选例中，所述碳霉糖合成基因簇包含基因tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV及tylCI。在另一优选例中，所述碳霉糖合成基因簇的序列如SEQIDNO：1所示。在另一优选例中，所述的连接序列为0-200bp长度的碱基序列。在本专利技术的第七方面，提供了一种宿主细胞，所述细胞含有第六方面所述的载体或染色体整合有碳霉糖合成基因簇上游和下游同源臂序列和3’同源臂序列，且缺失90%以上的碳霉糖合成基因簇。在另一优选例中，所述宿主细胞为大肠杆菌或链霉菌，较佳地大肠杆菌为E.coliDH5α和E.coliET12567，链霉菌为弗氏链霉菌NRRL2702。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明下列附图用于说明本专利技术的具体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种泰乐菌素产生菌，其特征在于，所述的产生菌的发酵产物中，泰乐菌素B(Tb)的相对含量满足下式：B/(A+B)≥95%式中，B为发酵产物中泰乐菌素B(Tb)的质量；A为发酵产物中泰乐菌素A(Ta)的质量。

【技术特征摘要】
1.一种泰乐菌素产生菌，其特征在于，所述的产生菌的发酵产物中，泰乐菌素B(Tb)的相对含量满足下式：B/(A+B)≥95％式中，B为发酵产物中泰乐菌素B(Tb)的质量；A为发酵产物中泰乐菌素A(Ta)的质量；所述产生菌的基因组中碳霉糖合成基因簇被失活或敲除；其中，所述泰乐菌素产生菌是弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)；和所述碳霉糖合成基因簇包含基因tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV和tylCII。2.如权利要求1所述的泰乐菌素产生菌，其特征在于，所述泰乐菌素产生菌为弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)SWL00020，保藏编号为：CGMCCNo.6717。3.如权利要求1所述的泰乐菌素产生菌，其特征在于，所述产生菌中缺失以下5种基因：tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV和tylCII。4.如权利要求1所述的泰乐菌素产生菌，其特征在于，所述产生菌不表达以下5种基因：tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV及tylCII。5.一种权利要求1所述的泰乐菌素产生菌的用途，其特征在于，它被用做发酵生产泰乐菌素B(Tb)的工程菌株。6.一种生产泰乐菌素B(Tb)的方法，其特征在于，包括步骤：(a)培养权利要求1所述的泰乐菌素产生菌，从而产生含有泰乐菌素B的发酵产物；和(b)从发酵产物中分离出泰乐菌素B(Tb)。7.一种生产替米考...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文，赵群飞，张华，董坤，彭欣，李慧芬，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，山东鲁抗舍里乐药业有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31