用于异戊二烯生产的组合物和方法技术

本发明专利技术内容描述了由木质纤维素植物生物量使用腐生菌的基因工程菌株来生产异戊二烯的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本
技术实现思路
描述了由木质纤维素植物生物量使用腐生菌的基因工程菌株来生产异戊二烯的组合物和方法。【专利说明】相关申请本申请要求享有2011年7月13日提交的美国临时申请第61/507，532号的优先权，该申请的全部内容通过引证在此全部并入本文。提交的申请本
技术实现思路
涉及由使用腐生菌的基因工程菌株的木质纤维素植物生物量来生产异戊二烯的组合物和方法。
技术介绍
在橡胶和某些塑料的生产中，异戊二烯是一种重要的化学前体。根据一些估计，在2008年，生产了大约800，000吨的异戊二烯。在化学工业中所使用的几乎所有的异戊二烯都是由石油衍生得到的，但是，在自然界中，这些异戊二烯是由许多植物产生的。据估计，植物每年向大气层中散发大约1000亿千克的异戊二烯。尽管这样，很少有“绿色”来替代石油化工生产的异戊二烯。最有前景的替代技术，使用许多基因修饰的微生物来将有机物转化为异戊二烯。目前，这些生物体的大多数可以使用单糖作为底物用于异戊二烯的生物合成。这样的糖在自然界的数量是非常有限的。另外，同样的单糖还可用来作为动物饲料或者人类食品。与此同时，根据能源部门(DOE) 了解到，木质纤维素生物量是地球上最大的可持续碳资源。每年，美国可将相同来源的十亿吨纤维素生物量转换为生物燃料。现在，需要一种通过木质纤维素生物量来生产异戊二烯的方法。专利技术概述 在一些实施方案中，本申请提供了培养的细胞，所述细胞通过使用单糖和二糖或者复杂的碳水化合物，产生了异戊二烯，其中复杂的碳水化合物包括，但不限于，纤维素、淀粉、半纤维素和甲壳素。在一些实施方案中，所述细胞具有编码连接到一种启动子上的异戊二烯合成酶的异源核酸。在一些实施方案中，上述细胞在一种生长培养基中进行培养，所述生长培养基包括来自海水的矿物盐、类似氯化铵的无机氮源、肽、蛋白质、来自酵母提取物和蛋白胨的维生素和氨基酸、碳源(如葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉或者纤维素)、以及来自玉米芯的半纤维素。在一些实施方案中，所述细胞包含一种编码异戊二烯合成酶的异源核酸，并且所述异戊二烯合成酶可操作的连接到tac启动子上。在生长培养基上，在异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(缩写为IPTG)存在下，这些细胞开始产生异戊二烯。在一些实施方案中，所述细胞包含一种编码异戊二烯合成酶的异源核酸，所述异戊二烯合成酶可操作的连接到cel9A启动子上。在生长培养基上，在仅有纤维素、半纤维素或者果胶存在下，这些细胞产生异戊二烯。在一些实施方案中，编码异戊二烯合成酶的异源核酸设计为与S.degradans的密码子使用相匹配，并且合成性地构建。【专利附图】【附图说明】附图1是MEP/D0XP途径示意图。下列的缩写应用在附图1中:Pur_丙酮酸；G3P_ 甘油-3-憐酸(glyceraldehyde3_phosphate) ;DXS_ 脱氧木酮糖-5-憐酸合成酶(l-deoxy-D_xylulose5-phosphate synthase) ;DXP_ 脱氧木酮糖 _5_ 憐酸(l-deoxy-D_xylulose5-phosphate) ；DXR-脱氧木酮糖-5-憐酸还原酶(l-deoxy-D-xylulose5-phosphate reductase) ;MEP_2_C-甲基 _D_ 赤藓醇 _4_ 憐酸(2-C-methylerythrito 14-phosphate) ;CMS_4_ 二憐酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇合成酶(4_diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol synthase) ;CDP_ME_4-二憐酸胞苷-2_C_ 甲基赤藓醇激酶(4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase) ;CMK_4_ 二憐酸胞苷-2-C-甲基赤藓醇激酶(4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase)；CDP-MEP-2-C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二憐酸(2-C-methyl-D-erythritol2, 4-cyclodiphosphate) ;MCS_2_C-甲基-D-赤藓醇 _2，4_ 环二憐酸合成酶(2-C-methyl-D-erythrito12,4-cyclodiphosphate synthase) ;MEcPP_2_C-甲基 _D_ 赤藓醇 _2，4_ 环焦憐酸(2-C-methyl-D-erythrito 12, 4-cyclopyrophosphate) ；HD S_ (E) _4_ 羟基 _3_ 甲基-丁-2-烯基-焦憐酸合成酶((E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate synthase)；HMB-PP- (E) -4-羟基-3-甲基-丁 -2-烯基-焦憐酸((E) -4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyI pyrophosphate) ;HDR-(E)_4-羟基 _3_ 甲基-丁 _2_ 烯基-焦憐酸还原酶((E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate reductase) ; IPP-异戍烯基焦憐酸(isopentenylpyrophosphate) ;DMAPP_ 二甲基烯丙基焦憐酸(dimethylallyl pyrophosphate)。附图2显示了优化的用于在S.degradans中的表达的颤杨异戊二烯合成酶基因的管核苷酸序列(SEQ ID NO:1).附图3显示了优化的用于在S.degradans中的表达的野葛异戊二烯合成酶基因的寡核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。附图4显示的是优化的用于在S.degradans中的表达的的花生异戊二烯合成酶基因的寡核苷酸序列(SEQ IS NO:3) 0附图5显示的是质粒Pmmb503EH的示意图。附图6显示的是质粒pZym-1PTG的示意图。附图7是用于显示在发酵罐顶部空间内的异戊二烯浓度随着时间变化的线形图。附图8显示了在纤维素诱导性构建体中应用的cel9A启动子区域的序列(SEQ IDNO:4)。附图9显示了用于扩增cel9A启动子区域的引物的序列(SEQ ID NOs:5 (PromD)and6 (PromR))。Mlul和EcoRI限制性内切酶位点显示在下壳体。附图10显示了质粒pZym-Cel的示意图。
技术实现思路
本专利技术中描 述的组合物和方法,有效地利用了腐生菌Sharophagus degradans (S.degradans) 2-40本身的能力从而使在木质纤维素生物量中发现的几乎所有的复杂多糖产生代谢变化。通过改变在生物体中的类异戊二烯生物合成途径，在下述公开的内容中构建了一种利用植物衍生的生物量作为主要碳源的S.degradans异戊二烯生产菌株。活的生物体利用了两种主要的类异戊二烯生物合成途径:a)甲羟戊酸途径或者HMG-CoA还原酶途径，以及b)非甲羟戊酸途径或者2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸/脱氧木酮糖 _5_ 憐酸途径(2-C-methyl-D-erythritol4-phosphate/l-deoxy-D-xylulose本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海涛，M·苏沃罗夫，S·W·赫特切桑，
申请(专利权)人：阿梅蒂斯公司，
类型：
国别省市：