本发明专利技术公开了一种基于液质联用的丹磺酰氯衍生血浆中胺类物质的分析方法，其特征在于：采用丹磺酰氯作为衍生化试剂对含伯胺、仲胺的代谢物进行衍生化，从而增加胺类物质在反相色谱中的保留能力，并提高在质谱检测中的离子化效率，达到提高胺类物质定量准确性和检测灵敏度的目的。本发明专利技术对胺类代谢物覆盖面广（包括氨基酸及其甲基化、乙酰化产物，二肽等），可以利用100μL血浆样品检测到113个胺类物质，提供胺类物质代谢组的轮廓信息，并且具有特异性好、精确、重复性高、试剂消耗少等特点。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种，其特征在于：采用丹磺酰氯作为衍生化试剂对含伯胺、仲胺的代谢物进行衍生化，从而增加胺类物质在反相色谱中的保留能力，并提高在质谱检测中的离子化效率，达到提高胺类物质定量准确性和检测灵敏度的目的。本专利技术对胺类代谢物覆盖面广（包括氨基酸及其甲基化、乙酰化产物，二肽等），可以利用100μL血浆样品检测到113个胺类物质，提供胺类物质代谢组的轮廓信息，并且具有特异性好、精确、重复性高、试剂消耗少等特点。【专利说明】
本专利技术涉及分析化学和医学领域，是一种基于液相色谱-质谱联用的丹磺酰氯衍生以提高血浆中胺类物质代谢轮廓的分析方法。
技术介绍
胺类物质是人体代谢的基础，其主要代表氨基酸更是构成蛋白质的基本单位，具有重要的生化活性。二肽是由两个氨基酸脱水缩合形成的酰胺键组成的蛋白质片段或物质，与营养，荷尔蒙、酵素抑制、调节免疫、抗菌、抗病毒、抗氧化有非常紧密关系。此外，研究表明氨基酸的甲基化、乙酰化产物与人体健康状况密切相关，是肿瘤发生发展的重要特征。因此实现胺类物质进行代谢轮廓分析，对研究人体生理状态，疾病进程以及疗效评价等都具有重要的研究意义。胺类物质极性强，在反相液相色谱中难以保留，离子抑制严重，定量分析困难。目前，常用的定量分析方法是通过液相色谱-串联质谱多反应检测方法(LC-MRM)。这种方法速度快，样品预处理简单。但是由于不同的胺类物质极性差异较大，许多胺类物质色谱保留能力弱，且在离子化过程中的差异较大，许多胺类在电喷雾离子源中的离子化效率很低，造成其检测灵敏度差。因此在实际检测中，目前一般只能针对高含量的氨基酸进行检测和定量分析。衍生化方法是提高离子化效率一种比较常用的方法。利用胺类物质的化学特性，其反应活性通常随碱性的强弱而异，取代基的大小对反应活性的影响较大，位阻较大的胺反应活性降低。在本专利技术中，丹磺酰氯可以特异性衍生位阻适中的伯胺和仲胺代谢物，增强胺类物质在反相色谱中的保留，提高离子化效率从而达到更高的检测灵敏度。目前报道的文献和专利用丹磺酰氯衍生法对血浆中的几种氨基酸做了测定，但是覆盖面小，检测胺类物质少，没有一种血浆中胺类代谢轮廓分析方法。针对上述情况，我们提出了一种有望覆盖胺类代谢组的新检测技术和定性方法。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术不足，提供一种基于液相色谱-质谱联用的丹磺酰氯衍生血浆中胺类物质全谱的分析方法，使其用于检测人体血浆中胺类物质代谢轮廓，为了解机体的生理过程、疾病的发生发展机制、机体对病变和药物的应答以及个性化治疗方案提供有效的信息和依据。该方法具有特异性好、精确、重复性高、试剂消耗少等特点。根据此方法筛查出的标志物谱可以为癌症等疾病的深入研究提供根据。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下:具体步骤如下，第一步，用含乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂的采血管收集血浆，-80°C低温保存。分析前，将血浆解冻至常温，定量移取100 μ L于离心管中并加入含内标Glycine-d5，DL-Alanine-3,3,3_d3, L-Leucine-5, 5, 5_d3, Thymine-d3, PhenyIalanine-d5 以 及Tryptophan-d5的乙腈溶液400 μ L,内标在乙腈溶液中的浓度均为400ng/mL。第二步,将第一步得到的样品在4° C,转速15000rmp/min下离心lOmin。用移液枪取上清液体积450 μ L至离心管并在冻干机上冻干。第三步，向第二步中得到的冻干后血浆提取物中加入40 μ L浓度5mg/mL丹磺酰氯乙腈溶液以及40 μ L浓度均为0.15mol/L的Na2C03/NaHC03水溶液(PH=9.4)，涡旋时间lmin，将离心管封口密闭后60°C水浴反应50min。第四步，向离心管中加入20 μ L浓度为0.5mol/L的丁胺水溶液，涡旋时间为lmin。将离心管封口密闭后再次60°C水浴反应40min。第五步，将衍生完的样品在4°C,转速15000rmp/min下离心IOmin,取上清,进样10 μ L进行液相色谱-质谱联用检测。3)对丹磺酰氯衍生血浆样本依次进行液相色谱质联用分析；所述液相色谱-质谱联用检测的仪器为LTQ-Orbitrap (Thermo FisherScientific, USA)。液相条件为:ACQUITYHSS T3 柱(IOcmX 2.lmm, 1.8 μ m, Waters, Ireland),柱温60°C，进样量10 μ L，流动相A为体积浓度0.1%甲酸/水溶液，B为0.1%甲酸/乙腈；梯度洗脱条件:0?2min时维持98/2 (A/B，V/V)，逐渐改变梯度到20min变成20/80 (A/B,V/V),到 28min 变为 0/100 (A/B，V/V)并维持到 29min，29.0 ?29.1min 变成初始梯度 98/2 CA/B，V/V)并维持到30min，流速0.35mL/min，柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测。质谱条件为:电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测；使用高纯队辅助喷雾电离与脱溶剂，鞘气35个单位，辅助气5个单位；离子源温度325°C，喷雾电压为4500V，Centroid模式采集质谱数据；镜筒透镜电压90V，质量扫描范围m/z 80?1100，Orbitrap分辨率30000，获得被分析样本的总离子流图；最终得到血浆样本胺类物质的总离子流图，其即为胺类物质代谢轮廓谱。胺类物质是人体内最重要的代谢产物之一，其含量的变化不仅能反应人体正常情况下的生理状况，同时也能反应外界环境刺激和病变引起的变化。胺类物质代谢组的轮廓分析是一种表征人体综合状况的方法。本方法采用基于超高效液相色谱一高分辨质谱联用(UHPLC-LTQ Orbitrap)的代谢组学的研究平台，在较高的线速度下依然可以保持很好的分离度，缩短了分析时间，提高了分析通量。LTQ Orbitrap质谱的分辨率高，扫描速度快，一次分析可以得到大量代谢物信息，代谢物的质量精度高，为标志物的鉴定提供可靠的依据，节省鉴定时间，降低鉴定难度。结合衍生化方法检测血浆中的胺类物质代谢组，对照特征离子234.05887+M和307.1480+M进行定性(附图1 )，一次分析可以得到113个重要胺类物质的浓度信息，从而得到胺类物质代谢组的轮廓信息，使得可以从代谢角度了解人体内整体的胺类物质变化和响应。样本预处理过程中加入胺类同位素内标,通过内标的响应可以校正预处理过程和仪器运行过程中响应微小漂移带来的误差。样本序列分析过程中插入血浆样本的混合物作为质量控制(QC)样本。通过对QC样本总离子流图的监控，可以检测分析序列中仪器响应有无漂移，确保了实验数据的可靠性。血浆作为最直接反映人体代谢状况的体液库，在疾病诊断和药物评价等医药学中应用广泛。而且血检作为最常用的临床体检指标测定方法，适合于将代谢组的研究和临床的体检筛查结合，为临床体检指标提供新的思路和依据。通过检测胺类代谢组并结合统计方法，可以用于疾病早期的生物标记物的发现，从而为疾病的诊断提供新的思路和疾病的治疗提供可能新的靶标。本专利技术具有特异性好、精确、重复性高、试剂消耗少等特点。【专利附图】【附图说明】图1是本专利技术丹磺酰氯衍生胺类物质本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于液质联用的丹磺酰氯衍生血浆中胺类物质的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步，将血浆定量移取至离心管并加入含内标的提取溶液；在涡旋仪上涡旋后冰浴内静置，提取血浆中的代谢物并使蛋白变性，得血浆乙腈混合溶液；第二步，将血浆乙腈混合溶液在离心机上离心，用移液枪取出上清液置离心管内，上清液在冻干机上冻干；第三步，向第二步中得到的冻干后血浆提取物中加入丹磺酰氯乙腈溶液和Na2CO3/NaHCO3水溶液，涡旋混匀，对离心管封口密闭后采用水浴加热进行衍生化；第四步，向离心管中加入丁胺水溶液，涡旋混匀，对离心管封口密闭后再次水浴加热进行衍生化；第五步，将衍生完的样品离心，用移液枪取出，进行液相色谱‑质谱联用检测分析胺类物质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许国旺，黄强，尹沛源，戴伟东，路鑫，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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