本发明专利技术公开了重组人绒促性素融合蛋白(Human?chorionic?gonadotrophin-Fc?fusion?protein，简称HCG-Fc)及其制备方法，该HCG-Fc蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包括HCGβ亚基、HCGα亚基、柔性肽接头和人IgG?Fc变体，与现有绒促性素相比，其体内半衰期更长、生物利用度更高，可大大减少用药次数和剂量。本发明专利技术还涉及重组HCG-Fc融合蛋白组合物在制备动物繁殖领域药物中的用途。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了重组人绒促性素融合蛋白(Human?chorionic?gonadotrophin-Fc?fusion?protein，简称HCG-Fc)及其制备方法，该HCG-Fc蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包括HCGβ亚基、HCGα亚基、柔性肽接头和人IgG?Fc变体，与现有绒促性素相比，其体内半衰期更长、生物利用度更高，可大大减少用药次数和剂量。本专利技术还涉及重组HCG-Fc融合蛋白组合物在制备动物繁殖领域药物中的用途。【专利说明】长效重组绒促性素及其应用
本专利技术涉及分子生物学和兽药领域。更具体地，本专利技术涉及重组长效人绒促性素融合蛋白、其制备方法及应用。该融合蛋白体内半衰期显著延长，生物利用度显著增加，大大减少动物繁殖用药次数和剂量。
技术介绍
人绒促性素(Human chorionic gonadotrophin,简称HCG)是动物繁殖领域常用的药物主要成分，现有上市HCG主要为人尿中提取的生化品种，可用于鱼类和畜类的促排卵和催产。目前我国市场上的HCG主要为孕妇尿液中提取的产品，存在病毒污染、原料来源有限、采集困难、含量低及纯化过程复杂等缺陷。另外，因检测方法及病毒灭活技术的局限性以及一些不可预知的新致病病毒感染时有发生，并不能完全杜绝生化提取产品发生病毒污染的可能性。相比而言，重组HCG在其纯度、抗原性、安全性、无病毒感染等方面具有生化HCG产品无法比拟的优点。迄今为止，还未有重组HCG产品用于兽药领域。HCG是一种糖基化蛋白，SDS-PAGE检测其分子量为50KD。另外，HCG是具有两条单链(α链和β链)的糖基化蛋白，链间以非共价键连接，两条链的正确折叠才能保证HCG的生物活性。如何在蛋白表达和纯化过程中保持两条链的正常结合是一个挑战。作为一种治疗药物，保证其生物活性，必要的条件是具有正确的三维结构和糖基化修饰。具有完善翻译后修饰功能是哺乳动物细胞被选作大多数生物药蛋白表达宿主的主因。其中，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese HamsterOvary Cell，简称CH0)是用于真核生物外源基因表达最为成功的宿主细胞，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达，很多人用重组蛋白药物已上市。与其它表达系统相比，该系统具有许多优点，如拥有完备的翻译后加工过程，包括糖基化、羟基化，使表达的外源真核基因产物能够保持其天然结构及活性，且使表达产物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分离纯化。`目前已有利用CHO细胞生产的人用药物重组HCG上市，但仍然存在如下问题:首先，现有方法生产的重组HCG表达量太低，制备过程复杂，生产成本太高；其次，其半衰期短，需要频繁注射给药，特别是在鱼类的催产过程中，频繁的抓取亲鱼容易对亲鱼造成鳞片脱落、病毒入侵等伤害。因此，利用分子生物学和细胞培养方法，开发具有生物活性和更长半衰期的重组HCG药物是本领域的一个挑战。
技术实现思路
本专利技术旨在提供重组人绒促性素融合蛋白(Human chorionic gonadotrophin-Fcfusion protein,简称HCG-Fc)及其制备方法及应用，该重组HCG-Fc融合蛋白应用于动物繁殖领域，与现有生化提取产品活性类似，且具有纯度高、半衰期显著延长等特点。本专利技术的一个目的是提供重组HCG-Fc融合蛋白，该融合蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包含HCGii亚基、HCGa亚基、肽接头(Linker，简称 L)和人 IgG Fe 变体(vIgG2Fc、vIgG4Fc 和 vlgGlFc)，如 SEQ ID NO:2、4 和 6 所示(HCG β -HCG a -vIgG2Fc、HCG β -HCG α -vIgG4Fc、HCG β -HCG α -vlgGlFc 氨基酸序列)，优选的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 (HCG β -HCG a -vIgG2Fc)，上述融合蛋白统称为HCG_Fc。所述的HCGii亚基的氨基酸序列去除了完整HCGii亚基中的1_20位氨基酸残基，即成熟HCGii亚基的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。所述的HCG α亚基的氨基酸残基序列去除了完整HCG α亚基中的1_24位氨基酸残基，即成熟HCGa亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。所述的肽接头含有2-20个氨基酸残基，且肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸残基，优选的肽接头氨基酸序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerο所述的人IgG Fe变体包括:(I)含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；(2)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域；(3)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgGl绞链区、CH2和CH3区域。优选的人IgGFc变体是，含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域。以下具体介绍本专利技术的人IgG Fe变体、肽接头功能:IgG Fe 变体IIgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质，它们的半衰期可高达21天，而Fe片段是IgG保持体内较长半衰期的主要原因，同时具有稳定蛋白的作用。Fe来自免疫球蛋白的Fe区域，Fe在消灭病原体的免疫防御中具有重要作用。IgG的效应子功能由Fe介导，通`过两种主要机制:(I)与细胞表面Fe受体(FcyRs)的结合，通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)途径消化病原体，或(2)与第一补体成分Cl的Clq部分的结合，引发依赖于补体的细胞毒性(CDC)途径，从而裂解病原体。在四种人IgG同种型中，IgGl和IgG3能有效的结合FcyRs0 IgG4与Fe Y Rs的结合亲和力比IgGl和IgG3的低一个数量级，而IgG2与Fe Y Rs的结合低得难以测定。人IgGl和IgG3还能有效地结合Clq，并激活补体级联反应。人IgG2对补体的固定很弱，而IgG4表现极端缺乏激活补体级联的能力。对于医疗用途而言，重组二聚化蛋白的Fe区域必须不会介导效应子功能而裂解或除去这些细胞。因此，HCG-Fc的Fe区域必须是非裂解性的，即在结合Fe Y Rs和Clq而触发效应子功能方面，Fe最好是无活性的。显然，没有一种天然的IgG同种型适合产生HCG-L-Fc重组二聚化蛋白。为了得到非裂解性的Fe，必须使天然Fe区域中的一些氨基酸突变，以减少其效应子功能。通过分析不同种属的IgG同种型的氨基酸序列，发现CH2区域氨基末端附近的Fe部分显示在IgG Fe与Fe Y Rs的结合中起作用，而与Clq结合至关重要的部分位于人IgG的CH2区域羧基端附近。为了减少Fe与FcyRs和Clq的结合而引发的效应子功能，本专利技术使用下列人IgG Fe变体(图1):⑴IgG2Fc变体:含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域；(2) IgG4Fc变体:含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和 CH3 区域；(3) IgGlFc 变体:含有 Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组HCG?Fc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包含HCGβ亚基、HCGα亚基、肽接头和人IgGFc变体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：侯永敏，雷瑶，邓衡露，
申请(专利权)人：广州诺新生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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