一种N-保护哌啶醇的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种N-保护哌啶醇的生产方法，所述N-保护哌啶醇的结构式为其中，R为叔丁氧羰基或苄基，其特征在于，所述生产方法以N-保护哌啶酮为底物，在醇脱氢酶、ADH-A、异丙醇和NAD+的存在下反应获得，所述醇脱氢酶为cpsADH或cmADHmut。本发明专利技术的方法高效简便，具有较好的工业应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地说，是关于一种N-保护哌啶醇的生产方法。
技术介绍
(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶（(S)-1-Boc-3-hydroxypiperidine）可用于合成抗充血性心力衰竭药卡莫瑞林（Philip A Carpino et al.Pyrazolinone-piperidine dipeptide growth hormone secretagogues(GHSs):Discovery of capromorelin.Bioorganic&Medicinal Chemistry,2003,11(4):581-590），也可用于淋巴癌新药伊布鲁替尼（ibrutinib）的合成。(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶可以由化学催化或者拆分获得，但是由于效率较低，反应条件苛刻，产生的三废较多，工业化成本较高。生物催化不对称合成手性醇已得到广泛应用，(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的生物催化不对称合成虽然已有报道，但至今没有一种高效的方法，例如：文献（Lacheretz R et al.Daucus carota Mediated-Reduction of Cyclic3-Oxo-amines.Organic Letters,2009,11(6):1245-1248）中报道的转化率只有73%，ee值只有95%，不具有工业应用价值；CN201310173088.2虽然披露了生物催化可以实现高效转化，但没有披露具体的催化用酶。
技术实现思路
本申请的专利技术人在长期的研究中发现，以N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮（1-Boc-3-oxopiperidine）或1-苄基-3-哌啶酮（1-benzylpiperidin-3-one）为底物，以ADH-A/异丙醇为辅酶NADH再生体系，cpsADH和cmADHmut能够催化N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮和1-苄基-3-哌啶酮产生相应的哌啶醇的ee值超过99.5%，具有较好的工业应用价值。因此，本专利技术的一个目的在于提供一种N-保护哌啶醇的生产方法。本专利技术提供了一种N-保护哌啶醇的生产方法，所述N-保护哌啶醇的结构式为其中，R为叔丁氧羰基或苄基，所述生产方法以N-保护哌啶酮为底物，在醇脱氢酶、ADH-A、异丙醇和NAD+的存在下反应获得，所述醇脱氢酶为cpsADH或cmADHmut。根据本专利技术，所述ADH-A具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，所述cpsADH具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述cmADHmut具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。根据本专利技术，所述反应的反应温度为30～40℃。根据本专利技术，在反应体系中，所述底物的浓度为2%～20%（w/v），所述异丙醇的浓度为10%～20%（v/v），所述NAD+的浓度为0.003%～0.005%（w/v）。根据本专利技术，在反应体系中，所述ADH-A的浓度为20000～40000U/L。根据本专利技术，所述醇脱氢酶为表达所述醇脱氢酶的重组大肠杆菌发酵培养的菌体、菌体破碎液或提取的酶冻干粉。根据本专利技术，所述表达所述醇脱氢酶的重组大肠杆菌发酵培养的方法如下：培养基：LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.2；TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油5g/L，KH2PO42.13g/L，K2HPO4·3H2O16.43g/L，pH7.0～7.5；发酵培养条件：将表达所述醇脱氢酶的重组大肠杆菌接种到LB液体培养基中，37℃、220rpm培养过夜后，按1%接种量接种到TB培养基中，37℃、220rpm培养至OD600=5～6，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷，28℃下诱导过夜。根据本专利技术，在反应体系中，所述醇脱氢酶的浓度为0.01%～0.5%（w/v）。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种N-保护哌啶醇的生物催化方法，以N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮或1-苄基-3-哌啶酮为底物，以ADH-A/异丙醇为辅酶NADH再生体系，cpsADH和cmADHmut能够催化N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮和1-苄基-3-哌啶酮产生相应的哌啶醇，产物ee值超过99.5%。本专利技术的方法高效简便，具有较好的工业应用价值。附图说明图1为本专利技术的反应示意图，其中，（A）为N保护基团为叔丁氧羰基，（B）为N保护基团为苄基。图2为N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶标准品HPLC图谱。图3为cmADHmut转化的HPLC图谱。图4为cpsADH转化的HPLC图谱。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。本专利技术中，如图1（A）所示，以N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮（1-Boc-3-oxopiperidine）为底物，以ADH-A/异丙醇为辅酶NADH再生体系，通过筛选得到cpsADH和cmADHmut能够催化N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮产生的(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶（(S)-1-Boc-3-hydroxypiperidine）的ee值超过99.5%，具有较好的工业应用价值。类似地，如图1（B）所示，当N保护基团由叔丁氧羰基（Boc）改为苄基后，以1-苄基-3-哌啶酮（1-benzylpiperidin-3-one）为底物，以ADH-A/异丙醇为辅酶NADH再生体系，cpsADH和cmADHmut也能催化1-苄基-3-哌啶酮产生的(S)-1-苄基-3-羟基哌啶（(S)-1-benzylpiperidin-3-ol）的ee值超过99.5%，具有较好的工业应用价值。以下实施例中所述全基因合成及亚克隆全部委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。以下实施例中所述表达重组大肠杆菌的发酵方法如下：培养基配制方法：LB培养基（蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.2）；TB培养基（蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油5g/L，KH2PO42.13g/L，K2HPO4·3H2O16.43g/L，pH7.0～7.5）；121℃高温高压灭菌20分钟。发酵培养条件：将构建好的菌种分别接种到含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养过夜后，按1%接种量接种到新鲜TB培养基中（含100μg/mL卡那霉素），37℃、220rpm培养至OD600=5～6，加本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种N-保护哌啶醇的生产方法，所述N-保护哌啶醇的结构式为
其中，R为叔丁氧羰基或苄基，其特征在于，所述生产
方法以N-保护哌啶酮为底物，在醇脱氢酶、ADH-A、异丙醇和NAD+的存在
下反应获得，所述醇脱氢酶为cpsADH或cmADHmut。
2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述ADH-A具有如SEQ 
ID NO：4所示的氨基酸序列，所述cpsADH具有如SEQ ID NO：5所示的氨
基酸序列，所述cmADHmut具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述反应的反应温度为
30～40℃。
4.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，在反应体系中，所述底
物的浓度为2%～20%（w/v），所述异丙醇的浓度为10%～20%（v/v），所述
NAD+的浓度为0.003%～0.005%（w/v）。
5.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，在反应体系中，所述ADH-A
的浓度为20000～40000U/L。

【专利技术属性】
技术研发人员：陶荣盛，
申请(专利权)人：上海工业生物技术研发中心，中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心，
类型：发明
国别省市：