本发明专利技术涉及生物技术中基因表达领域，特别涉及一种高效表达的猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因，如序列表中序列2所示，还涉及猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因表达蛋白在增强高致病性PRRSV灭活疫苗体液免疫和细胞免疫应答中的应用。含有序列表中序列2的真核质粒pMVAX1?表达pGMCSF蛋白基因，突破了通过pVAX1?载体表达pGMCSF过程中遇到的表达量较低和活性较差的局限性，表达量提高了6.6倍；猪体试验证明，序列表中序列2基因的表达蛋白pGMCSF表达活性很高，能够显著增强高致病性PRRSV灭活疫苗的体液免疫和细胞免疫应答，专用于对高致病性PRRSV引起的疾病的预防及减少猪场的经济损失。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术中基因表达领域，特别涉及一种高效表达的猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因，还涉及其表达蛋白的用途。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗称〃猪蓝耳病〃，由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV)引起,病毒感染后可以导致母猪流产、返情、产死胎或弱仔、仔猪死亡及各种年龄的猪不同程度的呼吸道症状，并且能破坏猪的免疫系统，引起混合感染或继发感染。我国于1995年底爆发此病，并迅速蔓延到全国多个省份。在许多规模化猪场，PRRS阳性率很高，有的可达80%以上。自2006年以来，我国部分地区猪场发生了由PRRSV变异株导致的高致病性蓝耳病。该病在临床上以发病猪高热、呼吸困难、皮肤发红为主要特征，具有更高的发病率和死亡率，给我国的养猪业造成了极为严重的经济损失。该病目前有灭活苗使用，但是免疫效果不尽理想。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)是由活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞等在某些抗原和细胞因子刺激下产生，可刺激造血细胞的增殖和分化、促进粒细胞和单核/巨噬细胞形成集落，增强其功能的一类细胞因子。GMCSF具有的生物学活性有:诱导造血前体细胞分化增殖，维持造血前体细胞和成熟血细胞的存活；增强中性粒细胞和巨噬细胞·的吞噬和杀伤功能；诱导树突状细胞成熟，并向疫苗注射部位集聚，使其具有明显的增强疫苗免疫反应的作用。因此它在疾病的治疗、预防及作为疫苗佐剂方面具有广泛的应用前景。Inumaru 和 Takamatsu 在 1995 年首先克隆了 pGMCSF 基因，Inumaru 等在 1998 年用杆状病毒表达了具有生物学活性的PGMCSF，随后国内外学者用大肠杆菌原核表达载体、质粒真核表达载体、腺病毒等表达了 PGMCSF，对其生物学活性进行了大量研究。本课题组也曾将pGMCSF克隆入真核表达载体pVAXl°，转染HEK-293A细胞后pGMCSF的表达量和活性较低。
技术实现思路
为了解决以上粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)表达量和活性低的问题，本专利技术提供了一种能够高效表达的猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因。本专利技术还提供了所述猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因表达蛋白在高效增强高致病性PRRSV灭活疫苗体液免疫和细胞免疫应答中的用途。本专利技术是通过以下措施实现的: 一种闻效表达的猪粒细胞巨曬细胞集落刺激因子基因，其核昔酸序列如序列表中序列2所示。一种序列2的基因通过分子生物学技术克隆至真核表达载体获得的重组质粒。一种所述的猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因的合成方法，包括以下步骤 1、将真核质粒pVAXf改造为pMVAX广:由 GenBank 公布的 Rabbit β -Globin Intron II 基因序列 GenBank No: V00882,在上游引入AiI酶切位点和pCMV即刻早期启动子的一段序列，在下游引入T7启动子序列和&oRI酶切位点，人工拼接后的核苷酸序列如序列表中序列I所示,将此段基因序列通过5^1/^boRI酶切位点插入pVAXf载体中，转化感受态细菌，提取质粒经筛选得到SstV双酶切阳性克隆，命名为PMVAXle ； 所述 pCMV 即刻早期启动子的一段序列为:5’ -GTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGC-3，, 所述 17 启动子序列为:5’ -AATACGACTCACTATAGGG-3’ ； 2、构建表达pGMCSF的重组真核质粒pMVAXl°-pGMCSF: 2.1设计一对扩增pGMCSF蛋白的基因序列的特异性引物，引物序列如下: pGMCSF-Fwd:5’ -TATGAATTCGGTACCACCATGGCTCCCACCCGCCCA-3’， pGMCSF-Rev:5’ -GAGCTCGAGAAGCTTACTTTTTGACTGGCCCC-3’， 在上游引物pGMCSF-Fwd的5’端引入&oRI限制性内切酶位点和Kozak序列，在下游引物pGMCSF-Rev的5’端引入通ol限制性内切酶位点； 2.2从猪的脾淋巴细胞提取RNA，经反转录后得到cDNA，采用RT-PCR技术扩增出pGMCSF蛋白基因的PCR产物； 2.3用feoRI/ZAoI双酶切pMVAXl°，胶回收得包含序列I的载体基因片段1，pGMCSF蛋白基因的PCR产物经feoRI/ZAoI双酶切并胶回收得到编码pGMCSF蛋白的基因片段2，将载体基因片段I和基因片段2连接，转化感受态细菌，培养，挑取菌落于卡那霉素抗性的培养基中培养，提取质粒，进行双酶切鉴定，筛选出阳性克隆，得pMVAXl°-pGMCSF，在真核质粒pVAXl°中插入的基因核苷酸序列如序列表中序列2所示，插入过程示意图如图1所示。步骤2.2 中 PCR 反应体系为 25μ ，含 cDNA lPL，Mg2+ 1.5mmol/L,dNTP 200Mmol/L,IOXLA PCR Buffer 2.5μ ，pGMCSF-Fwd和 pGMCSF-Rev 浓度均为 400nmol/L，TaKaRa LA Taq2U;反应条件为:预变性95° C 5min，然后进行35个循环，循环条件为95° C45s，60° C45s, 72° C 45s ;然后72° C延伸lOmin，取出产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳。一 种所述的猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因的表达蛋白在增强高致病性PRRSV灭活疫苗体液免疫和细胞免疫应答中的应用。本专利技术的有益效果是: (1)含有序列表中序列2的真核质粒pMVAXl°-pGMCSF表达pGMCSF蛋白基因，突破了通过pVAXl°载体表达pGMCSF过程中遇到的表达量较低和活性较差的局限性，表达量提高了6.6 倍; (2)猪体试验证明，序列表中序列2基因的表达蛋白pGMCSF表达活性很高，能够显著增强高致病性PRRSV灭活疫苗的体液免疫和细胞免疫应答，专用于对高致病性PRRSV引起的疾病的预防及减少猪场的经济损失。附图说明图1为本专利技术将真核质粒pVAXl°改造为pMVAXl°及克隆pGMCSF蛋白基因入pMVAXl°的不意 图2为本专利技术重组质粒pMVAXfAiIzfe0RI双酶切鉴定图谱，其中 M 为 DL2, OOO DNA Marker, I为重组阳性质粒ρΜνΑΧΓ的5^1/^boRI双酶切结果； 图3为本专利技术重组质粒pMVAXl°-pGMCSF的&0RI/ZA0I双酶切鉴定图谱，其中 M 为 DL2, 000 DNA Marker, I和2为两个不同重组阳性质粒pMVAXr-pGMCSF的&0RI/ZA0I双酶切结果； 图4为本专利技术重组质粒pMVAXf-pGMCSF表达的pGMCSF的Western_blot检测，其中 泳道I为空载体质粒PVAXf转染HEK-293A后West本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高效表达的猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杜以军，齐静，王金宝，吴家强，黄保华，郭立辉，陈蕾，丛晓燕，孙文博，任素芳，李俊，时建立，吕伟，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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