一种血管平滑肌L型钙离子通道免疫原性肽段及其用途，属于生物技术和医药领域。所述的免疫原性肽段具有如下的氨基酸序列：CGGPAEEDPS、CPAEEDPS、PAEEDPSGGC或PAEEDPSC，优选CPAEEDPS。将包含第一连接位点的血管平滑肌L型钙离子通道免疫原性肽段与一种或多种载体、优选地与重组Qβ-2aa噬菌体病毒样颗粒蛋白耦联结合，以形成有序、重复的多肽-载体疫苗。公开了该疫苗在治疗原发性高血压方面的应用，该疫苗能够产生高效的特异性的抗血管平滑肌L型钙离子通道免疫原性肽段的抗体，该抗体可以有效阻断L型钙离子通道，能够显著降低自发性高血压大鼠的血压。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和医药领域，具体涉及一种血管平滑肌L型钙离子通道免疫原性肽段的制备，以及用该肽段制备的疫苗在治疗原发性高血压的应用。
技术介绍
高血压是严重危害人类健康的世界性问题，中国高血压患病率18. 8% (2002年)， 目前全国有近2亿高血压患者。高血压是心脑血管病的主要危险因素，中国脑卒中发病率约250/10万人，冠心病发病率约50/10万人，积极控制高血压是预防脑卒中和冠心病的重要措施。目前中国门诊高血压患者治疗控制率30. 6 %，而中国高血压治疗总体控制率仅 6. I %。高血压发病机制复杂，其中血管平滑肌细胞L型钙离子通道的激活在高血压的发病中有重要作用，钙通道激活后导致细胞内钙离子浓度升高，一方面使得平滑肌细胞收缩，尤其在小动脉和微动脉，使得血管阻力增加血压升高，此外，细胞内钙离子浓度升高亦可促进多种转录因子的表达，参与血管重构和血管炎症等病变。导致血压升高各种因素均参与钙通道激活，导致血管收缩，因此，抑制血管平滑肌 L型钙通道的钙通道阻滞剂是目前高血压治疗的有效药物，尤其是长效钙通道阻滞剂如硝苯地平控释片，氨氯地平等在高血压治疗中疗效确切且安全有效，被广泛使用。但是由于化学药物需要每日定时服药，患者治疗依从性不佳，导致高血压治疗控制率低，免疫学的发展为高血压治疗提供新的途径，迄今为止，用于高血压治疗的疫苗主要针对RAS系统，其中瑞士Cytos公司的CYT006-AngQP疫苗已经完成了 IIa期临床实验,有较好的降压效果。目前国际上尚未有使用主动或被动免疫方法阻滞钙离子通道，从而达到降低血压的相关报道。
技术实现思路
本专利技术旨在制备血管平滑肌L型钙离子通道免疫原性肽段，并将其与一种载体特别是病毒样颗粒耦联后制备成一种多肽-载体疫苗，将该疫苗用于治疗原发性高血压。此外，针对该肽段的抗体可以有效阻断L型钙离子通道。该专利技术通过以下技术方案实现首先合成人血管平滑肌L型钙离子通道免疫原性肽段CGGPAEEDPS、CPAEEDPS、 PAEEDPSGGC、PAEEDPSC，该免疫原性肽段包含第一连接位点，至少能够通过一个共价键与载体的第二连接位点结合。使用重组QP噬菌体颗粒蛋白、重组牛乳头瘤病毒蛋白、重组乙型肝炎病毒蛋白、匙孔血蓝素蛋白、破伤风类毒素作为载体，这些载体至少具有一个第二连接位点，优选的第二连接位点包括氨基、羧基和巯基，选自赖氨酸残基、精氨酸残基、谷氨酸残基、天冬氨酸残基和半胱氨酸残基，优选赖氨酸残基。使用异双功能交联剂将血管平滑肌L型钙离子通道免疫原性肽段与上述载体、优选地与重组Qβ噬菌体颗粒蛋白耦联结合， 以形成有序、重复的多肽-载体疫苗。免疫原性肽段多肽被重复并以一定密度展示排列在载体上或者表面，形成高抗原性的阵列展示，利于高效的特异性的抗人和大鼠血管平滑肌L 型钙离子通道免疫原性肽段抗体的生成，可以有效阻断L型钙通道介导的细胞内钙离子浓度升高以及后续级联升压效应，显著降低自发性高血压大鼠的血压，可用于原发性高血压的治疗。本专利技术的优点是I、合成的肽段可以在自发性高血压大鼠体内引起特异性的免疫应答，产生针对肽段的特异性抗体。所产生的抗体能够与L型钙离子通道特异性结合，阻断通道开发引起的血管收缩及血压升高。2、使用的异双功能交联剂具有能够同时连接两种基团的特点，而且不同的基团可以通过两步先后连接上去，这些基团是巯基、氨基、羧基和胍基，而这些异双功能交联剂是 SMCC、Sulfo-SMCC, LC-SMCC 等。3、本专利技术制备的多肽-载体疫苗主要用于治疗原发性高血压，能够显著降低自发性高血压大鼠的血压，此外，针对多肽的抗体可以有效阻断L型钙离子通道。附图说明图I :Q β Ca-OOl疫苗制备后鉴定。图为病毒样颗粒和短妝I禹联后 Tricine-SDS-PAGE电泳结果，M为Marker，泳道2为病毒样颗粒单体，泳道I为耦联短肽后病毒样颗粒图2:免疫印迹法和细胞免疫荧光鉴定Anti-CN-8的特异性。Anti_CN_8为 Q^Ca-OOl疫苗免疫动物后的抗肽抗体，Con为阴性对照抗体。图中A :免疫印迹法鉴定 Anti-CN-8的特异性。图中B :细胞免疫荧光鉴定Anti_CN_8的特异性。图3 :用激光共聚焦显微镜观测Anti-CN-8抑制Bay K8644刺激引起的血管平滑肌细胞内钙离子浓度升高。匕、Ffflax分别代表平衡后血管平滑肌细胞基础和最大荧光强度。图4 :用全细胞膜片钳研究抗体对通道的作用，结果表明30nM Anti-CN-8可以有效抑制Ba2+电流，主要通过抑制L型钙通道的激活实现，而对通道失活没有明显影响。图5 :SHRs血压变化趋势图。图中A为SHRs收缩压趋势图；图中B为SHRs免疫后抗体滴度变化图(标本按I : 1000稀释)。分为两组QPCa-OOl疫苗组和空白对照组， Q β Ca-OOl疫苗抗Ca-OOl短肽抗体Anti-CN-8滴度。具体实施例方式以下结合说明书附图和实施例对本专利技术作进一步的说明，但不是限制本专利技术。实施案例I Q β Ca-OOl疫苗的制备和鉴定短肽CPAEEDPS由上海吉尔生化有限公司直接合成，短肽纯度95%。载体QP _2aa病毒样颗粒由本实验室构建表达并纯化得到，纯度90%以上(已申请国家专利技术专利，专利申请号201010028904. 7)。其按以下方法制备I)将Q β噬菌体CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为强终止密码子TAA后，克隆至原核表达载体pET28a(+)中，得到编码CP蛋白质粒pETQi3 -CP ；2)在QP噬菌体CP延伸蛋白基因中编码免疫优势决定区位置，即QP噬菌体CP 延伸蛋白基因第72位至73位密码子间，插入编码赖氨酸和亮氨酸的核苷酸AAGCTT，并将 CP蛋白基因终止密码子由TGA突变为GGA后克隆至原核表达载体PGEX4T-2中，得到编码 Al蛋白质粒pGEXQ0-Al ；43)突变后编码Qβ噬菌体CP蛋白质粒与Al蛋白质粒共同转化大肠杆菌，诱导后表达得到病毒样颗粒蛋白QP _2aa。使用异双功能交联剂Sulfo-SMCC (Pierce，MSA)将短肽CPAEEDPS与载体QP病毒样颗粒进行耦联制备QP Ca-OOl疫苗，其步骤如下I)称取Sulfo-SMCC试剂2mg，400 μ I纯水完全溶解后加入至20mg Q β病毒样颗粒(10mg/ml)中，混匀，室温放置30分钟；2)将活化的载体加入至IOOK的TFF浓缩柱(Mi 11 ipore，MSA)中，添加50mM PBS (含 ImM EDTA, pH 7. 2)，5，OOOg 离心 3 次，脱去游离的 Sulfo-SMCC ；3)称取短肽约5mg，50mM PBS (含ImM EDTA, pH 7. 2) Iml充分溶解加入活化的载体中，室温反应I小时，每隔20min轻轻振荡一次；4)将疫苗混合物加入至100K的TFF浓缩柱，5，OOOg离心3次，脱除游离的未反应的该短肽；Tricine-SDS-PAGE和免疫电镜鉴定Q β Ca-OOl疫苗(图I)。图中为病毒样颗粒和短肽耦联后Tricine-SDS-PAGE电泳结果，M为Marker，泳道2为病毒样颗粒单体，泳道 I为耦联短肽后病毒样颗粒单体，电泳结果显示QP _2aa噬本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：廖玉华，陈霄，周子华，邱志华，陈芬，杨仕俊，林吉斌，丁丹，王敏，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：
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