单唾液酸四己糖神经节苷脂钠制剂的制备方法技术

本发明专利技术是一种单唾液酸四己糖神经节苷脂钠制剂的制备方法。它是用新鲜或冻存猪脑或牛脑去除表面的包膜及血管等，用冷丙酮，经多次的按压脱水，用有机膜过滤澄清，倾出丙酮后，处理成丙酮粉密闭分装，保存备用；对丙酮粉提取澄清液，用超滤膜进行超滤，得到的超滤液，经萃取液萃提，用纳滤膜进行纳滤浓缩，除去小分子，弃透过液，收集得清亮的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠浓缩液；经除菌得精制品。本发明专利技术改变了提取有机溶剂的极性，神经节苷脂几乎全部释放到溶液中。本发明专利技术根据神经节苷脂在唾液酸和酰氨基团数目的差异，选用离子型纳滤膜将其分离和转化。采用现代膜分离技术取代填料，代替柱层析技术获得成功，节省大量溶剂和时间，提高了产率。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药品的制备方法，具体地是从动物组织中分离提取以单唾液酸四己糖神经节苷脂钠(GM1)为主要成分的糖脂类物质的制备方法。
技术介绍
神经节苷脂(Gangliosides，GLS)是一类含唾液酸(N-乙酰神经氨酸)的酸性糖脂，是哺乳动物细胞膜的重要成分，它由一族异构的含唾液酸残基的结构复杂的膜糖脂，其分子皆由一个疏水的神经酰胺部分和一个亲水的唾液酸寡糖基团组成。神经节苷脂分子既有水溶性，又有脂溶性，是一种两亲性分子；按唾液酸残基的位置和寡糖核心区的长度，将神经节苷脂分为不同的种类，其中GM1为单唾液酸四己糖神经节苷脂。它具有多种重要的生物学功能，已成为当今生命科学研究的热门课题，单唾液酸四己糖神经节苷脂钠在临床上已用于神经损伤性疾病的治疗。对于单个神经节苷脂而言，GM1，GD1b及GT1集中于突触前后膜。神经节苷脂位于神经元细胞膜双层结构外层，神经酰胺一端嵌入膜内，而寡糖链一端伸出细胞膜外突入外环境。神经节苷脂的这种非对称性分布以及它们的化学性质差异，使其特别易与各种细胞外信息发生相互反应，从而在细胞膜活动上充当重要角色。神经节苷脂在神经元胞体中含量略低于平均水平，而在突触小体中含量高于平均水平。神经节苷脂GM1在神经系统中的主要生理作用是1.促进神经细胞的生长、分化发育和神经再生；2.参与突触传递，维持脑的正常机能，参与各种学习记忆活动；3.在细胞与细胞，细胞与微生物以及细胞与基质间的相互作用过程中起介导作用；4.调节细胞膜中各种蛋白质功能，如离子通道，表皮生长因子受体等。实验证明外源性神经节苷脂尤其是单唾液酸四己糖神经节苷脂钠能嵌入神经细胞膜，模仿内源性神经节苷脂的某些功能，调节膜介导的细胞功能，并能刺激中枢神经系统损伤后潜在的代替机制阻止损害的发展，保护未受损的神经组织；同时还能影响体外培养的神经元的生长及其活性，促进其存活及生长。由意大利Fidia公司从牛脑组织中提取的GM1注射液(商品名Sygen)已于90年代正式在我国销售。由于GM1能通过血脑屏障，注射后快速在大脑和脊髓组织中分散，因此临床上GM1治疗效果十分显著。主要用于治疗人血管性或创伤性中枢神经系统损伤，如脑卒中，急性脊髓损伤和脑外伤。补充神经节苷脂，一方面降解脂褐素的积累，另一方面修复被破坏的脑神经细胞，从而达到延缓神经细胞衰老、增强脑动力，恢复脑功能。神经节苷脂及GM1提取和分离纯化已有文献和专利报道。其主要提取方法是猪脑或牛脑经绞拌，用丙酮脱水制成丙酮粉。再用氯仿、甲醇、水混合有机溶剂提取[Svennerholm.et al Biochemical et BiophsicaActa，617-109(1980)]。提取物神经节苷脂转入水相[J.Folch，The Journal ofBiological Chemistry，226，497-509(1957)]。用DEAE-Sephadex-A25纯化[R.W.Ledeen，et al.Journal of Neurochemistry，21，829(1973)]。硅胶层析，GM1得率达到14％。神经节苷脂的分离有用a环糊精技术(EP00469352A1)，也用大孔径树脂吸附技术(CN85102590)。神经节苷脂脱唾液酸有用唾液酸酶处理法(Richard Kuhn，etal.，Chemische berichte，1963.96.886)。有用加热处理法(US4868292)以及微生物处理方法(Fukano Y，et al.，Appl EnvironMicrobiol，1997.63.1861)。GM1纯化方法Momoi TaKashi建立了阴离子交换层析技术(Biochim Biophys Acta，1976，411，488)。亲和层析技术(Krishna Kant，etal J.Chromato，1989.494289)等。国内外实验室多采用DEAE-Sephadex和latrobeads大颗粒硅胶球进行柱层析分离提取。上述方法的缺点是有机溶剂消耗量大，费时，两种填料均需进口，故成本高。
技术实现思路
本专利技术的目的是创立以现代生物膜为核心的大规模制备神经节苷脂的方法。具体的制备方法是1)用新鲜(或冻存)猪或牛脑去除表面的包膜及血管等，在室温条件下加1～10倍体积的冷丙酮，经3～6次的按压脱水，用多层纱布过滤，用孔径为0.1～1.0um微孔有机膜过滤澄清，倾出丙酮后，将脱水后的脑组织研碎，置60-80℃烘干(不能用明火)，用干磨粉碎至细粉，得丙酮粉，密闭分装，保存备用； 2)取丙酮粉5.0Kg，加用三氯甲烷∶异丙醇∶水＝10～50∶20～80∶0.1～10配制成的提取液5～50Kg搅拌1～3小时，过滤得澄清液，再加入0.1～10纯化水进行分提，得上层清液用截流分子量为1000～10万的超滤膜进行超滤，得到的超滤液，经萃取液萃提，萃取液为氯仿∶甲醇∶0.1～4.0mol/L醋酸盐(钠盐、钾盐等)＝1～4∶1.5～8∶0.1～1.5配制成；小心颠倒两次后静止分层；取上层液再用截流分子量为100～1000的纳滤膜进行纳滤浓缩1/5～1/10体积时即可，除去小分子，弃透过液，收集清亮的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠浓缩液；经除菌得精制品。经此步分离纯化的GM1经高效液相色谱分析其纯度大于95％。3)制备的浓缩液经稀配后、灌装成成品，制成无菌制剂，既为达到国家药品质量标准的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液。或2)步骤所得的浓缩液，经0.2um孔径的微孔滤膜除菌过滤、分装、低温真空冷冻干燥后成乳白色或灰白色的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠干粉，即为单唾液酸四己糖神经节苷脂钠无菌冻干粉针剂。本专利技术改变了提取有机溶剂的极性，神经节苷脂几乎全部释放到溶液中。经测定神经节苷脂全部进入上层水相，而色素及大部分磷脂、硫脂等其它物质分配到下层有机相。本专利技术根据神经节苷脂在唾液酸和酰氨基团数目的差异，选用离子型纳滤膜将其分离和转化。经此步分离纯化的GM1经高效液相色谱分析其纯度大于95％。本专利技术采用现代膜分离技术取代上述两种填料，代替柱层析技术获得成功，节省大量溶剂和时间，提高了产率。具体实施例方式实施例11)用新鲜(或冻存)猪脑去除表面的包膜及血管等，在室温条件下加2倍体积的冷丙酮，经3次的按压脱水，用多层纱布过滤，用孔径为0.2um微孔有机膜过滤澄清，倾出丙酮后，将脱水后的脑组织研碎，置60～80℃烘干(不能用明火)，用干磨粉碎至细粉，得丙酮粉，密闭分装，保存备用；2)取丙酮粉5.0kg，加三氯甲烷∶异丙醇∶水＝10∶20∶0.1的体积比配制成的提取液6kg搅拌1～3小时，过滤得澄清液，再加入0.2kg的纯化水进行分提，得上层清液用截流分子量为3000的超滤膜进行超滤，得到超滤液，经萃取液萃提，萃取液为氯仿∶甲醇∶0.1～4.0mol/L醋酸钠＝1∶1.5∶0.1的体积比配制而成；取上层液再用截流分子量为300的纳滤膜进行纳滤浓缩至1/5体积时即可，弃透过液，收集得清亮的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠浓缩液；3)上述制备的浓缩液经稀配后、灌装成成品，制成无菌制剂，既为达到国家药品质量标准的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液。实施例21)用新鲜(或冻存)牛脑去除表面的包膜及血管等，在室温条件下加10倍体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单唾液酸四己糖神经节苷脂钠制剂的制备方法，其特征在于：１）用新鲜或冻存猪脑或牛脑去除表面的包膜及血管等，在室温条件下加１～１０倍体积的冷丙酮，经３～６次的按压脱水，用多层纱布过滤，用孔径为０．１～１．０ｕｍ微孔有机膜过滤澄清，倾 出丙酮后，将脱水后的脑组织研碎，置６０－８０℃烘干，用干磨粉碎至细粉，得丙酮粉密闭分装，保存备用；２）取丙酮粉５．０Ｋｇ，加三氯甲烷∶异丙醇∶水＝１０～５０∶２０～８０∶０．１～１０的体积比配制成的提取液５～５０Ｋｇ搅拌１～３小时， 取澄清液，再加入０．１～１０Ｋｇ的纯化水进行分提，得上层清液用截流分子量为０．１万～１０万的超滤膜进行超滤，得到的超滤液，经萃取液萃提，萃取液为氯仿∶甲醇∶０．１～４．０ｍｏｌ／Ｌ醋酸盐＝１～４∶１．５～８∶０．１～１．５的体积比配制而成；小心颠倒两次后静止分层；取上层液再用截流分子量为１００～１０００的纳滤膜进行纳滤浓缩１／５～１／１０体积时即可，除去小分子，弃透过液，收集得清亮的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠浓缩液；经除菌得精制品。经此步分离纯化的ＧＭ１经高效液相色谱分析其纯度大于９５％。３）配制的浓缩液经稀配后、灌装成成品，制成无菌制剂，既为达到国家药品质量标准的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液。或２）步骤所得的浓缩液，经０．２ｕｍ孔径的微孔滤膜除菌过滤、分装、低温真空冷冻干燥后成乳白色或灰白 色的单唾液酸四己糖神经节苷脂钠干粉，即为单唾液酸四己糖神经节苷脂钠无菌冻干粉针剂。...

【技术特征摘要】
1.一种单唾液酸四己糖神经节苷脂钠制剂的制备方法，其特征在于1)用新鲜或冻存猪脑或牛脑去除表面的包膜及血管等，在室温条件下加1～10倍体积的冷丙酮，经3～6次的按压脱水，用多层纱布过滤，用孔径为0.1～1.0um微孔有机膜过滤澄清，倾出丙酮后，将脱水后的脑组织研碎，置60-80℃烘干，用干磨粉碎至细粉，得丙酮粉密闭分装，保存备用；2)取丙酮粉5.0Kg，加三氯甲烷∶异丙醇∶水＝10～50∶20～80∶0.1～10的体积比配制成的提取液5～50Kg搅拌1～3小时，取澄清液，再加入0.1～10Kg的纯化水进行分提，得上层清液用截流分子量为0.1万～10万的超滤膜进行超滤，得到的超滤液，经萃取液萃提，萃取液为氯仿∶甲醇∶0....

【专利技术属性】
技术研发人员：严家定，
申请(专利权)人：严家定，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]