【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于盐藻藻种纯化，尤其涉及一种利用半固体培养基分离纯化盐藻藻种的方法。
技术介绍
1、盐藻是单细胞真核藻类，具有动植物双重特性，是迄今为止发现的最耐盐的真核生物之一。盐藻细胞具有两条等长的鞭毛，使得其可以自由活动。盐藻含有丰富的油脂、β-胡萝卜素、蛋白质、多糖等物质，具有清除自由基、调节酸碱平衡的功效。盐藻中含有丰富的盐藻素和70多种矿物质，使得其在医药领域得到广泛应用。另外，盐藻没有细胞壁，可作鱼虾贝等幼体的饵料，其所含的营养物质易于吸收且提高鱼虾的免疫力和抗病能力，可开发“绿色饲料”。基于盐藻巨大的经济价值和独特的优点，很多国家和地区都在大规模的培养和开发盐藻。盐藻在培养一段时间后，容易老化也容易感染其他种类微生物，所以在培养过程中需要对盐藻进行定期纯化和筛选。
2、传统的盐藻纯化方法主要包括稀释水滴分离法、涂布法和微细管分离等方法。稀释水滴分离法需进行大量重复操作且成功率低；稀释涂布法中，平板表面的盐分易于析出从而使得盐藻破裂死亡，成功率较低；微细管分离法操作难度较大。同时，在实验室现有条件下对已有盐藻藻种进行了藻种混合琼脂倒平板法，此方法中琼脂温度不易控制，温度偏高会使得盐藻细胞死亡，温度偏低使得盐藻细胞难以混合均匀，且盐藻在固体培养基中其活动受到限制，氧气缺乏导致盐藻生长速度缓慢，纯化周期较长(40～50天)。
3、本专利技术采用的半固体培养基纯化盐藻，大大降低琼脂浓度的同时，又保持培养基质有一定的稳定性，使得盐藻细胞可以在富含培养液的低浓度琼脂中能够固定住且有一定的活动空间和充足的氧
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种利用半固体培养基分离纯化盐藻藻种的方法，有效解决传统的盐藻纯化方法成功率低及纯化周期长的问题。
2、为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：
3、一种利用半固体培养基分离纯化盐藻藻种的方法，包括以下步骤：
4、s1、配制青霉素、氯霉素和土霉素三种抗生素溶液，在生长初期的盐藻藻液中加入三种所述抗生素溶液，继续培养两天后，第二次加入三种所述抗生素溶液，再继续培养两天后，第三次加入三种所述抗生素溶液，继续培养两天后得抗生素处理藻液。
5、s2、配制盐藻自养所需的液体培养基，将一定量的琼脂粉加入所述液体培养基中，然后通过蒸汽灭菌锅灭菌，得灭菌后的培养基。
6、s3、将灭菌后的培养基倾倒平板。
7、s4、将所述抗生素处理藻液进行稀释后，使用喷雾法固定到经步骤s3制得的平板中进行培养，得到单克隆藻株。
8、s5、挑取步骤s4中的单克隆藻株在经步骤s3制得的平板上进行平板划线，直至得到纯化的单克隆藻株。
9、s6、将步骤s5中已纯化的单克隆藻株转移至添加有10～20ml的所述液体培养基的50ml三角瓶中，置于无菌室中，光暗比l：d＝12h：12h进行培养，即得纯化筛选后的盐藻藻种。
10、进一步地，步骤s1中，所述青霉素溶液的浓度为10～60ppm、氯霉素溶液的浓度为10～60ppm、土霉素溶液的浓度为10～60ppm。
11、进一步地，步骤s2中，所述液体培养基的组分配比为：每升自来水中其他组分配比为：氯化钠60.000g/l，氯化镁0.594g/l，硫酸镁0.244g/l，氯化钾0.200g/l，氯化钙0.035g/l，硝酸钾0.5g/l，碳酸氢钠0.151g/l，磷酸二氢钾0.043g/l，edta二钠1.89mg/l，氯化铁1.47mg/l，氯化锌4.0g/l，硼酸610mg/l。
12、进一步地，步骤s2中，所述琼脂粉的加入量占所述液体培养基质量的0.2～0.5％。
13、进一步地，步骤s4中，所述抗生素处理藻液的稀释倍数为一万倍。
14、进一步地，步骤s4中，所述培养条件为：光照强度1000～3000lx，温度27℃，光暗比l：d＝12h：12h，培养15～20天。
15、本专利技术的有益技术效果是：
16、(1)本专利技术通过在一种盐藻自养培养液中加入一定比例的固体琼脂粉，配制成易于盐藻生长的半固体培养基。所述半固体培养基能够成为盐藻细胞生长的载体，同时使盐藻细胞有一定的活动空间以及充足的氧气从而快速生长。所需原料丰富易得而且价格成本低廉。在更短时间内得到纯度较高的藻种，缩短生长周期，提高大规模生长的成功几率。从而达到增加产量降低成本的目的。
17、(2)本专利技术通过在盐藻的前期处理中添加抗生素能够显著抑制杂菌生长，可使盐藻在固定到培养平板上后减少杂菌干扰，快速生长形成藻落，在短时间内得到纯度相对较高的藻种，缩短盐藻生长纯化周期，提高大规模生长的成功几率。
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1.一种利用半固体培养基分离纯化盐藻藻种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的利用半固体培养基分离纯化盐藻藻种的方法，其特征在于，步骤S1中，所述青霉素溶液的浓度为10～60ppm、氯霉素溶液的浓度为10～60ppm、土霉素溶液的浓度为10～60ppm。
3.根据权利要求2所述的利用半固体培养基分离纯化盐藻藻种的方法，其特征在于，步骤S2中，所述液体培养基的组分配比为：每升自来水中其他组分配比为：氯化钠60.000g/L，氯化镁0.594g/L，硫酸镁0.244g/L，氯化钾0.200g/L，氯化钙0.035g/L，硝酸钾0.5g/L，碳酸氢钠0.151g/L，磷酸二氢钾0.043g/L，EDTA二钠1.89mg/L，氯化铁1.47mg/L，氯化锌4.0g/L，硼酸610mg/L。
4.根据权利要求3所述的利用半固体培养基分离纯化盐藻藻种的方法，其特征在于，步骤S2中，所述琼脂粉的加入量占所述液体培养基质量的0.2～0.5％。
5.根据权利要求4所述的利用半固体培养基分离纯化盐藻藻种的方法，其特征在于，步骤S4
6.根据权利要求5所述的利用半固体培养基分离纯化盐藻藻种的方法，其特征在于，步骤S4中，所述培养条件为：光照强度1000～3000Lx，温度27℃，光暗比L：D＝12h：12h，培养15～20天。
...【技术特征摘要】
1.一种利用半固体培养基分离纯化盐藻藻种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的利用半固体培养基分离纯化盐藻藻种的方法，其特征在于，步骤s1中，所述青霉素溶液的浓度为10～60ppm、氯霉素溶液的浓度为10～60ppm、土霉素溶液的浓度为10～60ppm。
3.根据权利要求2所述的利用半固体培养基分离纯化盐藻藻种的方法，其特征在于，步骤s2中，所述液体培养基的组分配比为：每升自来水中其他组分配比为：氯化钠60.000g/l，氯化镁0.594g/l，硫酸镁0.244g/l，氯化钾0.200g/l，氯化钙0.035g/l，硝酸钾0.5g/l，碳酸氢钠0.151g/l，磷酸二氢钾...
【专利技术属性】
技术研发人员：李悦明，李霞，张健，王玲玲，徐炳政，宁兴燕，韩萍，李娜，王振宇，
申请(专利权)人：青岛琅琊台集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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