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【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药领域,具体地说涉及一种磷酸吡哆醛的制备方法。
技术介绍
1、磷酸吡哆醛是维生素b6的活性形式,它参与催化的很多反应的进行,包括转氨基作用、α-脱羧作用、β-脱羧作用、β-消除作用、γ-消除作用、消旋作用以及羟醛反应等。磷酸吡哆醛作为维生素b6的衍生物在医药上有多种用途,治疗原因不明的白细胞减少症,治疗破伤风抗血栓作用,治疗口腔溃疡,治疗贫血,治疗动脉粥样硬化,治疗痤疮等。研究还表明,磷酸吡哆醛不但可以用于预防治疗高血压、心血管疾病及糖尿病等,还可用于治疗迟发性运动障碍、难治性儿童期癫痫及帕金森综合征。总之,磷酸吡哆醛在诸多领域都有广泛应用,市场量大。
2、目前,磷酸吡哆醛的制备主要是以化学合成法进行的,有关其制备的化学合成法的报导很多,但化学方法存在步骤多而复杂、产率不理想、资源消耗多、废水污染等问题,而采用微生物酶转化技术来合成磷酸吡哆醛就可以解决这些问题,并能降低其生产成本。目前已经有了许多关于微生物转化技术生产磷酸吡哆醛的研究,多数都是运用各类菌株体内本身的代谢路径,或加以改造后直接通过发酵来制得磷酸吡哆醛,但目前运用菌株内的代谢路径来生产磷酸吡哆醛的方法其最终得率仍处于较低水平,通过微生物酶法来合成磷酸吡哆醛的方法仍有较高的改进空间。专利cn115094102a《一种用固定化酶制备磷酸吡哆醛的方法》,虽也是利用含有磷酸转移酶基因的菌体制备磷酸吡哆醛,但其为了固定化磷酸转移酶,操作时大肠杆菌菌体内的fmn(黄素单核苷酸)会有所损失,对其利用率极低,所以需要额外添加fmn,而fmn的价格昂贵
技术实现思路
1、专利技术目的:本专利技术的目的是提供了一种成本低、操作过程简单的磷酸吡哆醛的制备方法。
2、技术方案:本专利技术的磷酸吡哆醛的制备方法,包括以下步骤:
3、(1)配制含有底物吡哆醇的反应液:将吡哆醇、atp钠盐和无水硫酸镁混合溶解于pbs缓冲液中即得反应液,所述反应液的ph为4.0~7.3;
4、(2)将步骤(1)配制含有底物吡哆醇的反应液和含有磷酸转移酶基因的大肠杆菌菌体混合,反应完成后即得磷酸吡哆醇溶液;
5、(3)将步骤(2)中的磷酸吡哆醇溶液旋干后用盐酸溶液进行溶解,然后加入二氧化锰进行氧化反应,反应结束后即得磷酸吡哆醛溶液。
6、进一步地,步骤(1)中的反应液的ph为4.5~6.0。
7、进一步地,所述制备方法还包括对含有磷酸转移酶基因的大肠杆菌菌株发酵的步骤。
8、进一步地,所述的含有磷酸转移酶基因的大肠杆菌菌体的制备步骤包括:将磷酸转移酶的核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pbad连接得到重组载体,将重组载体转化进大肠杆菌top 10感受态细胞中。
9、进一步地,所述的含有磷酸转移酶基因的大肠杆菌菌体的制备步骤包括:将磷酸转移酶的核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pet-28a连接得到重组载体,将重组载体转化进大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中。
10、进一步地,所述制备方法还包括菌体的制备步骤:用清水及pbs缓冲液洗涤含有磷酸转移酶基因的大肠杆菌菌体,即得含有磷酸转移酶的洁净的大肠杆菌的菌体。
11、进一步地,步骤(1)中所述的吡哆醇:atp钠盐:无水硫酸镁的质量比为1:0.3~3.9:0.2~1.7。
12、进一步地,步骤(1)中所述的吡哆醇:atp钠盐:无水硫酸镁的质量比为1:0.3-3.6:0.2~1.7。
13、进一步地,步骤(2)中所述的含有底物吡哆醇的反应液中的吡哆醇和含有磷酸转移酶基因的大肠杆菌菌体的质量比应为1:1~10。
14、进一步地,步骤(2)中反应温度为30~80℃,反应时间为1~6h。
15、进一步地,步骤(3)中所述的盐酸溶液的浓度为1-20%。
16、进一步地,步骤(3)中的二氧化锰可分两次添加,且磷酸吡哆醇与二氧化锰的质量比应为1:0.4-2:0.4-2。
17、进一步地,步骤(3)中氧化反应的温度为15-80℃,反应时间为1-12h。
18、进一步地,步骤(3)还包括去除未完全反应的二氧化锰的步骤。
19、进一步地,所述去除未完全反应的二氧化锰的步骤为向磷酸吡哆醛溶液中加入九水硫化钠,反应结束后去除沉淀即可。
20、有益效果:与现有技术相比,本专利技术具有如下突出的显著优点:本专利技术的制备方法相较于现有的制备方法,优化了反应条件,以吡哆醇为原料,在无水硫酸镁和辅酶(atp钠盐)存在的条件下,直接通过发酵后的菌体制备磷酸吡哆醇,再经化学氧化生成磷酸吡哆醛。在制备磷酸吡哆醇时直接利用了菌体内的磷酸转移酶进行反应,不需再进行破碎等步骤处理获取酶液,操作过程简单;且菌体内的atp也能得到利用,可以额外减少atp的用量,反应后菌体经过滤或离心可以进行重复利用,以上操作都能进一步降低生产成本;化学氧化生成磷酸吡哆醛的过程操作简单,生产成本较低。总的来讲本方法具有成本低、操作过程简单、环保高效等优点,更加适用于工业化应用。
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1.一种磷酸吡哆醛的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
2.根据权利要求1所述的磷酸吡哆醛的制备方法,其特征在于,所述制备方法还包括对含有磷酸转移酶基因的大肠杆菌菌株发酵的步骤。
3.根据权利要求2所述的磷酸吡哆醛的制备方法,其特征在于,所述的含有磷酸转移酶基因的大肠杆菌菌体的制备步骤包括:将磷酸转移酶的核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pBAD连接得到重组载体,将重组载体转化进大肠杆菌TOP 10感受态细胞中。
4.根据权利要求2所述的磷酸吡哆醛的制备方法,其特征在于,所述的含有磷酸转移酶基因的大肠杆菌菌体的制备步骤包括:将磷酸转移酶的核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pET-28a连接得到重组载体,将重组载体转化进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。
5.根据权利要求1所述的磷酸吡哆醛的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述的吡哆醇:ATP钠盐:无水硫酸镁的质量比为1:0.3~3.9:0.2~1.7。
6.根据权利要求1所述的磷酸吡哆醛的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述的含有底物吡哆醇的反应液中的吡哆醇和
7.根据权利要求1所述的磷酸吡哆醛的制备方法,其特征在于,步骤(2)中反应温度为30~80℃,反应时间为1~6h。
8.根据权利要求1所述的磷酸吡哆醛的制备方法,其特征在于,步骤(3)中所述的盐酸溶液的浓度为1-20%。
9.根据权利要求1所述的磷酸吡哆醛的制备方法,其特征在于,步骤(3)中所述的磷酸吡哆醇与二氧化锰的质量比为1:0.4-2。
10.根据权利要求1所述的磷酸吡哆醛的制备方法,其特征在于,步骤(3)中所述的氧化反应温度为15-80℃,反应时间为1-12h。
...【技术特征摘要】
1.一种磷酸吡哆醛的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
2.根据权利要求1所述的磷酸吡哆醛的制备方法,其特征在于,所述制备方法还包括对含有磷酸转移酶基因的大肠杆菌菌株发酵的步骤。
3.根据权利要求2所述的磷酸吡哆醛的制备方法,其特征在于,所述的含有磷酸转移酶基因的大肠杆菌菌体的制备步骤包括:将磷酸转移酶的核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pbad连接得到重组载体,将重组载体转化进大肠杆菌top 10感受态细胞中。
4.根据权利要求2所述的磷酸吡哆醛的制备方法,其特征在于,所述的含有磷酸转移酶基因的大肠杆菌菌体的制备步骤包括:将磷酸转移酶的核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pet-28a连接得到重组载体,将重组载体转化进大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中。
5.根据权利要求1所述的磷酸吡哆醛的制备方法,其特征在于,步骤(1)中...
【专利技术属性】
技术研发人员:张坤晓,李梦磊,张笑清,史大华,侯学雯,曹阳,
申请(专利权)人:江苏海洋大学,
类型:发明
国别省市:
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