【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种核酸检测技术，特别涉及一种基于发夹探针介导的指数扩增反应，用于痕量核酸的灵敏特异检测。
技术介绍
1、在当今精准医学时代，准确高效地检测微量核酸对于疾病预防和早期诊断具有重要意义。基于扩增的方法是目前最实用的序列特异性核酸检测方法。在临床实践中，聚合酶链反应(pcr)通常是检测核酸的首选方法。然而，精确的热循环控制和专用设备的要求限制了其广泛应用。为了满足即时检测(poct)和便携式诊断的迫切需求，已经开发了一系列等温扩增方法。其中，基于指数扩增的方法因其可提供高效的扩增效率(接近2n)和迅速的扩增速率(～108倍)而广受欢迎，例如指数扩增反应(expar)，环介导等温扩增(lamp)，指数链置换扩增(e-sda)，指数滚环扩增(e-rca)等。
2、尽管在核酸和蛋白质检测方面取得了令人印象深刻的优势和成功，但指数扩增的方法的方法仍然受到一些限制。(1)靶标长度有限。已知经典的基于expar的方法适用于短的单链核酸(长度约10-30nt)，它可以与expar扩增模板的5‘端杂交，并留下粘性末端用于启动dna聚合。但当特征序列在3’端时，expar只能由长的单链核酸直接引发。(2)非特异性扩增。为了用expar方法分析长单链核酸和蛋白质，通常需要外源辅助探针作为引子来激活指数反应。.然而，外源探针可能会通过随机碰撞在没有靶标的情况下直接与模板杂交来启动扩增反应，这可能会导致大量的非特异性扩增。(3)在经典的expar中，由于模板是对称的，由于引物或扩增产物不可避免地杂交到模板的5‘端，因此扩增效率大大
3、为了应对这一挑战，本专利技术利用dna链置换的高特异性，开发了一种发夹探针介导的指数扩增反应(hear)策略，该策略能够进行灵敏和特异性的核酸检测痕量核酸。其工作原理是通过合理设计一对探针，其在靶标不存在时保持非活性结构。在目标存在的情况下，发夹1通过dna链置换打开，最终通过聚合酶延伸和切口酶切生成目标互补链。靶标互补链又可以打开发夹2生成目标链，进一步引发指数扩增反应。一方面，该策略通过dna链置换反应和目标作为模板表现出优异的特异性。另一方面，由于持续循环直到发夹用尽，该方法表现出令人满意的扩增效率。对于概念验证研究，let7a mirna被用作目标模型。我们证明，与引物介导的指数扩增反应(pear)相比，hear检测具有更高的灵敏度和特异性，检测限达到～am水平。该策略为核酸快速分析提供了一种简单的一锅法，无需复杂的引物设计，为即时检测提供了可能，在临床诊断和疾病治疗方面具有巨大潜力。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是开发出一种简单、灵敏且特异的痕量核酸检测策略。
2、具体技术方案如下：
3、一种基于发夹探针介导的指数扩增反应，其检测方法包括以下步骤：
4、(1)发夹退火发夹探针在95℃5min，以每秒0.1℃的速率下降至25℃，并保持5min，放在4℃备用。
5、(2)荧光检测流程为了检测不同浓度的mirna，a部分溶液由发夹1和发夹2组成。b部分溶液由dntp、聚合酶、切口核酸内切酶、cutsmart缓冲液、sybr i和rnase-free组成。首先，将a部分溶液在室温下孵育5分钟。随后，将a部分和b部分在43℃下混合，并通过带有sybr过滤器组的cfx96tm实时pcr检测系统以30秒的间隔监测荧光强度。所述步骤(1)中所用nabh4是500ul 1mol/l。
6、所述步骤(2)中发夹1的浓度是200nm。
7、所述步骤(2)中发夹2的浓度是200nm。
8、所述步骤(2)中dntp的浓度是250μm。
9、所述步骤(2)中聚合酶的类型是bst dna聚合酶。
10、所述步骤(2)中聚合酶的浓度是1.6u。
11、所述步骤(2)中聚合酶的类型是nt.bsmai切口核酸内切酶。
12、所述步骤(2)中聚合酶的浓度是5u。
13、所述步骤(2)中cutsmart缓冲液的浓度是1×。
14、所述步骤(2)中sybr i的浓度是2×。
15、本专利技术利用发夹探针建立了一种特异和灵敏的核酸检测方法。根据靶标设计探针序列，发夹由一个含有切口识别位点、茎序列和立足点序列的环组成。其检测原理为当靶标与发夹1共存时，发夹1通过立足点介导的链置换打开。在dna聚合酶存在的情况下，靶标沿着打开的发夹延伸，产生包含完整切口核酸内切酶识别位点的双链dna(dsdna)。切口核酸内切酶在双链复合体中的发夹1上产生链切割。然后，该切割位置继续启动置换、聚合和切口反应的连续循环，产生大量目标互补链(t')，这将导致第一个线性扩增反应。接下来，t'可以打开发夹2，引发类似的反应，产生大量与目标序列相同的单链dna(ssdna)，引起第二次线性扩增反应，两轮线性扩增相互循环实现指数扩增反应。最终信号由sybr green i实时监测，它可以插入dsdna。
16、page分析首先用于验证hear过程(附图1)。通过孵育hear实验所需的不同成分，研究了mirna激活的等温扩增反应。泳道1-5分别是靶标、h1、h2和靶标-h1和靶标-h1-h2。与存在所有成分(泳道7)相比，当缺乏切口酶(泳道6)或者发夹2(泳道8)或者靶标(泳道9)，没有产生明显的延伸或者切割条带，证明了该方法的可行性。
17、为了进一步分析hear介导的核酸检测，使用sybr green i作为荧光染料进行了实时荧光测定(附图2)。当bst聚合酶或nt.bsmai或h2不存在时，仅观察到微弱的荧光值，这归因于sybr green i嵌入dsdna的能力。反应速率由拐点(poi)定量描述，拐点是实时荧光曲线最大斜率对应的时间。当反应的所有成分都存在时(红色实线)，poi值实时荧光曲线的长度约为11分钟。在没有靶标的情况下，观察到低强度荧光增益(红色虚线)，这可能是dntp和发夹相互作用引起的非特异性扩增。与阳性样品相比，阴性样品的poi值(80分钟)要大得多，足以产生可区分的荧光信号。上述这些结果有力地证实了hear检测是由靶标正确启动和操作的，因此产生了“s”形生长的荧光曲线。
18、在43℃下验证了hear策略的定量性能(附图3)。对于高分辨率和高精度分析，将每个反应的poi值与靶标的浓度相对应，以对数标度绘制(附图4)。在100am(1zmol)和10nm(本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其特征在于包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的用两种发夹进行循环方法。
3.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其制备方法步骤(2)中发夹1的浓度是1μΜ-10nM。
4.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其制备方法步骤(2)中发夹2的浓度是1μΜ-10nM。
5.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其制备方法步骤(2)中dNTP的浓度是1mΜ-10nM。
6.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其制备方法步骤(2)中聚合酶的类型是Bst DNA聚合酶或者KF聚合酶。
7.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其制备方法步骤(2)中聚合酶的浓度是10-0.1U。
8.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增
9.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其制备方法步骤(2)中切口酶的浓度是10-0.1U。
10.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其制备方法步骤(2)中CutSmart缓冲液的浓度是10×-1×。
...【技术特征摘要】
1.一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其特征在于包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的用两种发夹进行循环方法。
3.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其制备方法步骤(2)中发夹1的浓度是1μμ-10nm。
4.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其制备方法步骤(2)中发夹2的浓度是1μμ-10nm。
5.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其制备方法步骤(2)中dntp的浓度是1mμ-10nm。
6.如权利要求1所述的一种基于发夹探针介导的指数扩增反应用于痕量核酸的灵敏特异检测，其制备方法步骤(2)中聚合酶的...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢国明，余红艳，翁智，
申请(专利权)人：重庆医科大学国际体外诊断研究院，
类型：发明
国别省市：
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