【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于菌种选育和微生物化妆品原料，具体是高产虾青素的红法夫酵母、复合诱变育种方法、红法夫酵母溶胞物及其应用。
技术介绍
1、红法夫酵母phaffia rhodozyma(pr)最初是从日本偏远地区和北美西海岸的树木渗出物中分离出来的，以单细胞为主，有时形成假菌丝，繁殖方式是芽殖，无论酵母细胞内还是细胞壁都含有丰富的营养物质。红法夫酵母是fda认证的安全的可食用微生物，也是生产天然虾青素的主要微生物。
2、虾青素又名虾黄素、虾黄质，属酮式类胡萝卜素,是一种萜烯类不饱和化合物，化学名称为3,3–二羟基–4,4–二酮基–β,β–胡萝卜素，分子式为c40h52o4，相对分子质量为596.86。固体形态的虾青素表现为粉红色的晶体，其熔点在216℃上下，不溶于水，但易溶于有机试剂例如：二氯甲烷，氯仿等。虾青素能吸收活性纯态氧而防止其它分子或组织被破坏，可作为活性纯态氧和其它活性自由基的淬灭剂而保护脂类及其他组织的过氧化反应。相关研究表明，虾青素的抗氧化活性大约是β胡萝卜素的10倍，是维生素e的80～55倍。虾青素最初被用作水产业的饲料添加剂，后来人们发现它具有极强的抗氧化活性、增强机体免疫力活性及抗肿瘤活性，在食品、医药和化妆品等领域中有着广阔的应用前景。
3、天然虾青素主要来源于藻类、酵母、蛙鱼、鳞鱼、虾等，而商品化的天然虾青素主要来源于雨声红球藻和红法夫酵母。在雨生红球藻中，虾青素主要以酯化形式存在，与游离虾青素相比，酯化态虾青素不易于被人体吸收利用。红法夫酵母发酵合成的虾青素结构形式为(3r，3'r)，
4、但是野生型的红法夫酵母产量较低无法直接用于商业化应用，为了获得更高产虾青素的红法夫酵母，紫外等物理和化学诱变是常采用的手段。目前，获得高产菌株的方法有物理、化学诱变和原生质体融合等传统方法以及许多转基因技术，但常用且有效的方法还是人工诱变法。李清儒等采用uv诱变、des诱变和复合诱变的方式进行诱变育种，获得红法夫酵母生物量为4.25mg/g，是诱变前菌株的1.42倍。龚玉娇等对野生型菌株用紫外线和亚硝基胍协同诱变，经筛选得到了虾青素高产突变菌株,其菌株虾青素最高产量达1200μg/gdcw比出发菌产量271μg/g dcw高近4倍。相比单一诱变因子，复合诱变具有补充不同诱变方法之间缺陷的优势，甲基磺酸乙酯(ems)是一种常用的化学诱变剂，能诱发产生高密度的系列等位基因点突变，具有效率高、负作用小、易操作等优点，目前已被广泛应用于植物的相关遗传研究和诱变育种工作中。紫外诱变作为一种物理诱变方法，能提高变异频率，加速育种进程。此前，没有将紫外诱变与ems进行红法夫酵母复合诱变的技术。
5、在化妆品原料领域中，酵母来源的原料种类已有上百种，包括酵母菌溶胞物、酵母发酵产物滤液、酵母提取物等。然而，在众多的酵母原料中，来源于酵母本身的活性物质却大同小异，缺乏创新。目前，化学合成的虾青素和雨生红球藻提取物是化妆品配方中虾青素的主要来源，化学合成的虾青素因效果差、不安全性逐渐退出市场，雨生红球藻提取物主要面临着成本高昂、提取工艺复杂的局面。因此，若以红法夫酵母为出发菌株，制备富含虾青素的酵母溶胞物可有效结合虾青素和酵母溶胞物二者的优势，有望成为化妆品配方中提供虾青素的新原料。然而，如何将亲脂性的虾青素在溶胞物的水系环境中稳定分散成为一个难题。通常虾青素主要以脂质体、微囊体、纳米乳等手段制备并包裹形成分散体，但这些手段均难以省略虾青素的提取步骤。酵母中天然存在磷脂双分子层的细胞膜结构，而磷脂分散于水中时会自发形成一类具有封闭双层结构的分子有序组合体，即囊泡也称为脂质体。根据磷脂在水溶液中自发形成囊泡的特性，可知在一定的剪切力下，细胞破碎后，被破碎的细胞膜可自发形成微米级的囊泡，胞内亲脂性物质也将在这个过程中包裹其中。jasmine m等人将通过均质、超声、离心大肠杆菌制备溶胞物，得到的细胞提取物就含有大量细胞膜破碎后重排形成的囊泡结构。红法夫酵母中虾青素的提取不仅工艺复杂，其中残留的有机试剂也是一个较大的安全隐患，因此以破碎红法夫酵母细胞本身形成的天然囊泡结构将亲脂性的虾青素包裹其中的红法夫溶胞物制备方法不仅工艺简单、成品也十分安全环保，在化妆品原料领域具有较大的市场潜力。
技术实现思路
1、针对现有技术中红法夫酵母产虾青素能力不足以实现工业化的情况，本专利技术将提供一种紫外诱变与甲基磺酸乙酯复合诱变红法夫以获得高产虾青素菌株的选育技术，并提供了一种以红法夫为出发菌株的化妆品原料的制备方法。本专利技术涉及利用甲基磺酸乙酯和紫外线复合诱变红法夫酵母，并结合二苯胺筛选得到高产虾青素且遗传性状稳定的红法夫酵母uve12(phaffia rhodozyma uve12)，以uve12为出发菌株，制备一种虾青素含量为细胞干重0.8％的红法夫酵母溶胞物，并提供一种以红法夫为出发菌株的化妆品原料的制备方法。具体技术方案如下：
2、一种高产虾青素的红法夫酵母uve12，保藏编号为cctccno：m20231668。
3、一种上述高产虾青素的红法夫酵母uve12的复合诱变育种方法，其特征在于包括如下步骤：
4、(1)菌种活化
5、沾取适量红法夫菌液在ym固体平板或斜面上划线，22℃培养3-5天，挑取单菌落接种到含ym液体培养基的试管中进行下一步培养，平板或斜面于4℃保存，得到活化的红法夫菌液；
6、(2)对数期菌悬液的制备
7、将(1)中活化好的菌液以2-5％的接种量转接到新鲜ym液体培养基中，22℃，150-200rpm，取对数生长期中期的菌液5000rpm离心10min，弃上清，pbs溶液洗涤菌体两次并重悬得到菌悬液；
8、(3)紫外诱变
9、取5ml菌悬液均匀分布在60mm的培养皿中，将培养皿放置在距紫外灯15cm处照射0.4min，后迅速避光15-30min，得到紫外诱变菌悬液；
10、(4)甲基磺酸乙酯诱变
11、上述紫外诱变菌悬液紧接着加入2％的甲基磺酸乙酯混匀，22℃，150-200rpm避光处理3min，迅速离心9000r/min 30s，弃上清，用pbs缓冲液水洗脱3次，得到复合诱变菌悬液；
12、(5)二苯胺初筛菌株
13、将复合诱变菌液梯度稀释，均匀涂布在含有80-120μmol/l二苯胺的ym固体平板上，将平板置于20-22℃培养箱中培养3-5天，挑选菌落大而红色色泽深的菌落为初筛菌株；
14、(6)菌株复筛
15、将初筛菌株挑到含有5mlym液体培养基的试管中，20-22℃，150-200rpm培养12本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高产虾青素的红法夫酵母UVE12，保藏编号为CCTCCNO：M20231668。
2.一种如权利要求1的高产虾青素的红法夫酵母UVE12的复合诱变育种方法，其特征在于包括如下步骤：
3.如权利要求2的复合诱变育种方法，其特征在于：
4.如权利要求2的复合诱变育种方法，其特征在于：
5.如权利要求2的复合诱变育种方法，其特征在于：
6.如权利要求2的复合诱变育种方法，其特征在于：
7.如权利要求2的复合诱变育种方法，其特征在于：
8.一种红法夫酵母溶胞物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
9.一种如权利要求8所述的红法夫酵母溶胞物在制备化妆品原料中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种高产虾青素的红法夫酵母uve12，保藏编号为cctccno：m20231668。
2.一种如权利要求1的高产虾青素的红法夫酵母uve12的复合诱变育种方法，其特征在于包括如下步骤：
3.如权利要求2的复合诱变育种方法，其特征在于：
4.如权利要求2的复合诱变育种方法，其特征在于：
<...【专利技术属性】
技术研发人员：林晓媚，刘芝芝，
申请(专利权)人：杭州拾光欣雅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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