高效降解有机磷农药肠杆菌属细菌及其培养方法技术

本发明专利技术提供一种高效降解有机磷农药肠杆菌属细菌Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ?ｌｕｄｗｉｇｉｉ及其培养方法，其特点在于：主要生物学特性为革兰氏阴性，菌体为短杆状，无芽孢，大小为０．６－１．１×１．２－２．５μｍ，单端丛生鞭毛，好氧菌，最适生长温度３０－３７℃，最适ｐＨ在７－８之间，在血琼脂培养基上培养４８ｈ，形成直径１－２ｍｍ菌落，呈圆形，淡黄色，不透明，隆起，边缘整齐，表面湿润，有光泽。该菌株１６ＳｒＤＮＡ的Ｇｅｎｂａｎｋ登陆号为ＧＱ３８０５７５。该菌株对甲基对硫磷、毒死蜱的耐受浓度在含有１％蔗糖的无机盐培养基中可达到５０００ｍｇ／Ｌ，对乐果的耐受浓度高达１００００ｍｇ／Ｌ，其耐受能力远远高于农业生产所使用的农业剂量，并对土壤中有机磷农药的降解率达到９０％以上，解决了农业生产中农药残留超标问题，可生产出绿色无公害的农产品。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术主要涉及利用微生物的方法降解有机磷农药残留，特别涉及一株高效降解 有机磷农药肠杆菌属细菌Enterobacter Iudwigii及其培养方法，适用于现代农业生产中 绿色无公害农产品的生产和加工。
技术介绍
自1944年德国拜耳公司首先发现有机磷具有杀虫特性并制造出第一种杀虫剂 “1605-对硫磷”以来，有机磷作为一类高效、广谱的杀虫剂被广泛应用，在很大程度上提 高了农作物的产量。但有机磷农药的毒性作用具有两面性一方面，可以有效控制或消灭 农业、林业的病、虫及杂草的危害，提高农产品的产量和质量；另一方面，使用农药也带来 环境污染，危害有益昆虫和鸟类，导致生态平衡失调。同时也造成农产品中的农药残留， 对人类健康产生危害。近年来，人们相继提出了“软农药(soft pesticides)”和“抑菌剂 (fungistatic)”等概念，生物农药也引起了人们的关注，但就目前的科技能力，化学农药在 很长的一段时间内还是不可替代的，有机磷农药残留问题直接威胁到人类的生存和可持续 发展，并成为发达国家设置绿色贸易壁垒的重要手段，因此解决环境中存在的农药残留问 题仍是世界各国的研究热点。生物修复(Bioremediation)是近年来发展起来的用于治理 环境污染的一门新技术，它主要是通过微生物的作用将环境中的有机污染物转化为CO2和 H2O等无毒无害或毒性较小的物质。生物修复特别是微生物对残留农药的去毒降解是目前 治理环境污染特别是农药污染的有效途径。通过微生物来降解消除土壤中的农药残留，从 而降低粮食、蔬菜、茶叶等农产品中的农残，提高农产品的品质和经济价值是可行的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于避免现有微生物液体菌剂生产技术不足之处而提供一种高效 降解有机磷农药肠杆菌属细菌及其培养方法。本专利技术的目的可以通过采用以下技术方案实现所述的高效降解有机磷农药肠杆 菌属细菌Enterobacter Iudwigii，其特点在于该菌株主要生物学特性为革兰氏阴性，菌 体为短杆状，无芽孢，大小为0. 6-1. 1 X 1. 2-2. 5 μ m,单端丛生鞭毛，好氧菌，最适生长温度 30-370C，最适pH在7-8之间，在血琼脂培养基上培养48h，形成直径l_2mm菌落，呈圆形， 淡黄色，不透明，隆起，边缘整齐，表面湿润，有光泽；该菌株分别以甲基对硫磷、毒死蜱、乐 果为碳源、氮源进行生长，对甲基对硫磷、毒死蜱的耐受浓度在含有蔗糖的无机盐培养 基中达到500mg/L，对乐果的耐受浓度达1000mg/L，该菌株应用于对土壤和农药生产废水 中有机磷农药的降解；该菌株16SrDNA的Genbank登陆号为GQ380575。保藏单位中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路，保藏日期2009年 6月8日，编号=CGMCC N0. 3092，该生物材料的分类命名=Enterobacter Iudwigii0所述的高效降解有机磷农药肠杆菌属细菌的培养方法，其特点在于有如下步骤(1)样品采集用无菌取样瓶采集长期受有机磷农药污染种植地的土壤，放入20°C的恒温箱中恒温1小时待用；(2)分离筛选将乐果、毒死蜱、甲基对硫磷农药分别稀释至浓度为0.0005% (0.005mg/mL)，在培养皿中加入0. 5mL农药，倒入15mL冷至45 50°C灭菌的PDA培养基， 立即混勻，制成平板，吸取ImL各稀释度土壤稀释液小心地滴在平板培养基表面中央位置， 涂布均勻，倒置30°C恒温箱内培养；(3)降解菌的富集培养1 2天后，待平板上长出菌落后，挑取单个菌落依次接种 到含有乐果、毒死蜱、甲基对硫磷农药的富集培养基；(4)纯化采用平板划线分离法纯化，挑取在最高浓度下生长的菌落在富集培养 基上划线，分离直到获得纯培养物。所述的培养过程中，其性能检测是进行下面各项指标的检测菌株对有机磷农药 耐受能力的测定、模拟土壤培养体系，测定菌株对有机磷农药的降解率和菌株降解有机磷 农药降解谱的测定。所述高效降解有机磷农药肠杆菌属细菌Enterobacter Ludwigii，其生理生化特 征的人工鉴定、VITEK32仪器鉴定结果如表1、表2所示表1肠杆菌属细菌Enterobacter Ludwigii人工鉴定生理生化特征<table>table see original document page 4</column></row><table>注“ + ”表示生长或反应阳性；“_”表示不生长或反应阴性表2肠杆菌属细菌Enterobacter Ludwigii VITEK 32仪器鉴定生理生化特征<table>table see original document page 5</column></row><table>注1. “ + ”表示生长或反应阳性；“_”表示不生长或反应阴性2.全自动微生物鉴定由兰州军区陆军总院协助完成本专利技术的效果所述的该菌株可分别以甲基对硫磷、毒死蜱、乐果为碳源、氮源进行生长，对甲基对硫磷、毒死蜱的耐受浓度在含有蔗糖的无机盐培养基中可达到500mg/L,对乐果的耐受浓度高达1000mg/L，其耐受能力远远高于农业生产所使用的农业剂量(防治水稻害虫使用中，每亩施用甲基对硫磷的浓度为0. 75mg/L ；乐果浓度0. 4mg/L ；毒死蜱浓度l.Omg/L)。在土壤模拟体系试验中，农药降解的第32天，该菌株对土壤中甲基对硫磷的降解率为93% ；培养第54天，对土壤中毒死蜱的降解率为71%。附图说明图1为肠杆菌属细菌Enterobacter Ludwigii扫描电镜照片(6000X)；图2为肠杆菌属细菌Enterobacter Ludwigii在血琼脂培养基生长照片；图3为肠杆菌属细菌Enterobacter Ludwigii在中国蓝培养基生长照片；图4为肠杆菌属细菌Enterobacter Ludwigii在麦康凯培养基生长照片；图5为肠杆菌属细菌Enterobacter Ludwigii降解甲基对硫磷的实施图；图6为肠杆菌属细菌Enterobacter Ludwigii降解毒死蜱的实施图。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明结合图1，所述的高效降解有机磷农药肠杆菌属细菌Enterobacter Iudwigii，其 菌体为短杆状，无芽孢，大小为0.6-1. 1 X 1.2-2. 5 μ m，单端丛生鞭毛。结合图2、3、4，该菌 株为革兰氏阴性，好氧菌，最适生长温度30-37°C，最适pH在7-8之间，在血琼脂培养基上培 养48h，形成直径l_2mm菌落，呈圆形，淡黄色，不透明，隆起，边缘整齐，表面湿润，有光泽。 该菌株16SrDNA的Genbank登陆号为GQ380575，于2009年06月08日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 3092。所述的，其特点在于有如下步 骤(1)样品采集用无菌取样瓶采集长期受有机磷农药污染种植地的土壤，放入 200C的恒温箱中恒温1小时待用，然后称5g 土壤，加入盛有45mL并装有玻璃珠的蒸馏水锥 形瓶中，摇床上振荡20min本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效降解有机磷农药肠杆菌属细菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｌｕｄｗｉｇｉｉ），其特征在于：该菌株主要生物学特性为革兰氏阴性，菌体为短杆状，无芽孢，大小为０．６－１．１×１．２－２．５μｍ，单端丛生鞭毛，好氧菌，最适生长温度３０－３７℃，最适ｐＨ在７－８之间，在血琼脂培养基上培养４８ｈ，形成直径１－２ｍｍ菌落，呈圆形，淡黄色，不透明，隆起，边缘整齐，表面湿润，有光泽；该菌株分别以甲基对硫磷、毒死蜱、乐果为碳源、氮源进行生长，对甲基对硫磷、毒死蜱的耐受浓度在含有１％蔗糖的无机盐培养基中达到５００ｍｇ／Ｌ，对乐果的耐受浓度达１０００ｍｇ／Ｌ，该菌株应用于对土壤和农药生产废水中有机磷农药的降解；该菌株１６ＳｒＤＮＡ的Ｇｅｎｂａｎｋ登陆号为ＧＱ３８０５７５，于２００９年０６月０８日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为ＣＧＭＣＣＮＯ．３０９２。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵萍，王雅，张轶，亓文静，
申请(专利权)人：兰州理工大学，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]