【技术实现步骤摘要】
外周血单个核细胞的培养液及培养方法
[0001]本专利技术属于细胞培养
,更具体为PBMC培养液及培养方法。
技术介绍
[0002]诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)是利用重编程技术获得的与胚胎干细胞功能类似的细胞。它具有分化为三胚层在内的所有细胞类型的潜能,是目前干细胞与组织再生研究领域的一项重大突破,因其解决了胚胎干细胞来源有限和伦理学障碍的难题,在医学领域展示了广阔的应用前景。目前,人iPSC细胞主要自皮肤成纤维细胞重编程而来,而从皮肤中取样面临着组织活检时间长,取材不方便,患者疼痛感强且有被细菌感染等风险,获取的细胞需要体外扩增到足量的成纤维细胞才能进行iPSC诱导,耗时较长。2010年,科学家从外周血细胞中诱导出iPSC,这项技术的出现为iPSC研究领域带来一次质的飞跃。相对于皮肤成纤维细胞,外周血取材方便,来源丰富,是一种理想的iPSC供体细胞,具有广泛的应用前景。
[0003]外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC),指外周血中具有单个核的细胞,包括淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和其它少量祖细胞(如造血干细胞等)。目前最常用分离外周血单个核细胞的方法为Ficoll密度梯度离心法,该方法得到的细胞纯度较好,红细胞比例少。外周血中分离出来的单个核细胞一般在体外采用FBS或含有动物来源的组份(如BSA)进行培养,此类PBMC培养液扩增培养的效率较差,细胞活性不高,且不利于临床应用。r/>[0004]因此,要使PBMC重编程为人诱导性多能干细胞得到广泛应用,必须开发一种无血清、无动物源成份的PBMC培养液,其能够快速高效地扩增PBMC,同时具有较高的重编程效率。
技术实现思路
[0005]本专利技术提供外周血单个核细胞(PBMC)培养液以及培养方法,可以在较好地维持PBMC细胞的群体特性的同时大大提高PBMC细胞培养和诱导干细胞重编程效率。
[0006]本专利技术一方面提供外周血单个核细胞(PBMC)培养液,所述培养液包括:基础培养基DMEM/F12和血细胞培养基StemPro
‑
34,以及细胞生长因子、L
‑
抗坏血酸、β
‑
疏基乙醇、亚硝酸钠、乙醇胺、ROCK抑制剂、人血清白蛋白、转铁蛋白、肝素钠和AHR抑制剂。
[0007]在一些实施方案中,所述ROCK抑制剂为Thiazovivin、Y
‑
27632或KD
‑
025;更优选地,所述ROCK抑制剂的浓度为1
‑
10μM/mL,更优选为5μM/mL。
[0008]在一些实施方案中,所述AHR抑制剂为SR1、PD98059、CH
‑
223191、AHR antagonist 2、AHR antagonist 4、GNF351或PDM2;更优选地,所述AHR抑制剂浓度为0.5
‑
5μM/mL,更优选为2μM/mL。
[0009]在一些实施方案中,所述培养液进一步包括去乙酰化酶抑制剂。
[0010]在一些实施方案中,所述去乙酰化酶抑制剂为VPA、NaBu、TSA或SAHA;更优选地,所
述去乙酰化酶抑制剂浓度为0.5
‑
5μM/mL,更优选为2μM/mL。
[0011]在一些实施方案中,所述培养液进一步包括GSK
‑
3抑制剂。
[0012]在一些实施方案中,所述GSK
‑
3抑制剂为CHIR99021、SB 216763、TWS119、LY2090314、Tideglusib或小分子化合物BIO;更优选地,所述GSK
‑
3抑制剂浓度为0.1
‑
1μM/mL,更优选为0.5μM/mL。
[0013]在一些实施方案中,所述培养液中包含的细胞生长因子包括所述的细胞生长因子包括SCF、IGF
‑
1、FLT
‑
3L、TPO、EPO和GM
‑
CSF。
[0014]在一些实施方案中,所述培养液中生长因子SCF的浓度为10
‑
100ng/mL,优选为10
‑
50ng/mL,更优选为25ng/mL。
[0015]在一些实施方案中,所述培养液中生长因子IGF
‑
1的浓度为10
‑
100ng/mL,优选为10
‑
50ng/mL,更优选为25ng/mL。
[0016]在一些实施方案中,所述培养液中生长因子FLT
‑
3L的浓度为10
‑
100ng/mL,优选为10
‑
50ng/mL,更优选为20ng/mL。
[0017]在一些实施方案中,所述培养液中生长因子TPO的浓度为10
‑
100ng/mL,优选为10
‑
50ng/mL,更优选为25ng/mL。
[0018]在一些实施方案中,所述培养液中生长因子EPO的浓度为10
‑
100ng/mL,优选为10
‑
50ng/mL,更优选为30ng/mL。
[0019]在一些实施方案中,所述培养液中生长因子GM
‑
CSF的浓度为10
‑
100ng/mL,优选为10
‑
50ng/mL,更优选为25ng/mL。
[0020]在一些实施方案中,所述培养液中L
‑
抗坏血酸浓度为100μM
‑
1mM/mL,优选为500μM/mL。
[0021]在一些实施方案中,所述培养液中β
‑
疏基乙醇浓度为1
‑
10μM/mL,优选为5μM/mL。
[0022]在一些实施方案中,所述培养液中亚硝酸钠浓度为1
‑
10μM/mL,优选为5μM/mL。
[0023]在一些实施方案中,所述培养液中乙醇胺浓度为1
‑
10μM/mL,优选为5μM/mL。
[0024]在一些实施方案中,所述培养液中人血清白蛋白浓度为5
‑
50g/L,优选为10g/L。
[0025]在一些实施方案中,所述培养液中转铁蛋白浓度为50
‑
500μg/mL,优选为75μg/mL。
[0026]在一些实施方案中,所述培养液中肝素钠浓度为50
‑
500μg/mL,优选为250μg/mL。
[0027]在一些实施方案中,所述培养液中DMEM/F12培养基和血细胞培养基StemPro
‑
34的体积比为1:0.9
‑
1.3。
[0028]本专利技术的另一方面提供外周血单个核细胞(PBMC)的培养方法,本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.外周血单个核细胞(PBMC)培养液,其特征在于,所述培养液包括:基础培养基DMEM/F12和血细胞培养基StemPro
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34,以及细胞生长因子、L
‑
抗坏血酸、β
‑
疏基乙醇、亚硝酸钠、乙醇胺、ROCK抑制剂、人血清白蛋白、转铁蛋白、肝素钠和AHR抑制剂;优选地,所述ROCK抑制剂为Thiazovivin、Y
‑
27632或KD
‑
025;更优选地,所述ROCK抑制剂的浓度为1
‑
10μM/mL,更优选为5μM/mL;优选地,所述AHR抑制剂为SR1、PD98059、CH
‑
223191、AHR antagonist 2、AHR antagonist 4、GNF351或PDM2;更优选地,所述AHR抑制剂浓度为0.5
‑
5μM/mL,更优选为2μM/mL。2.如权利要求1所述的外周血单个核细胞培养液,所述培养液还包括去乙酰化酶抑制剂;优选地,所述去乙酰化酶抑制剂为VPA、NaBu、TSA或SAHA;更优选地,所述去乙酰化酶抑制剂浓度为0.5
‑
5μM/mL,更优选为2μM/mL。3.如权利要求1或2所述的外周血单个核细胞培养液,所述培养液还包括GSK
‑
3抑制剂;优选地,所述GSK
‑
3抑制剂为CHIR99021、SB 216763、TWS119、LY2090314、Tideglusib或小分子化合物BIO;更优选地,所述GSK
‑
3抑制剂浓度为0.1
‑
1μM/mL,更优选为0.5μM/mL。4.如权利要求1
‑
3任一项所述的外周血单个核细胞培养液,其中所述的细胞生长因子包括SCF、IGF
‑
1、FLT
‑
3L、TPO、EPO和GM
‑
CSF。5.如权利要求4所述的外周血单个核细胞培养液,其中生长因子SCF的浓度为10
‑
100ng/mL,IGF
‑
1的浓度为10
‑
100ng/mL,FLT
‑
3L的浓度为10
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100ng/mL,TPO的浓度为10
‑
100ng/mL,EPO的浓度为10
‑
100ng/mL,GM
‑
CSF的浓度为10
‑
100ng/mL。6.如权利要求1
‑
3所述的外周血单个核细胞培养液,其中所述的细胞因子SCF浓度为25ng/mL,IGF
‑
1浓度为25ng/mL,FLT
‑
3L浓度为2...
【专利技术属性】
技术研发人员:高歌,周安宇,
申请(专利权)人:上海爱萨尔生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
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