【技术实现步骤摘要】
一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株、构建方法及其应用
[0001]本专利技术涉及生物医药
,具体涉及一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株、构建方法及其应用。
技术介绍
[0002]非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swinefever virus,ASFV)感染导致的家猪和野猪的烈性传染病,可致感染猪100% 发病和死亡。然而,目前世界上没有可用于非洲猪瘟防控的疫苗和药物,只 能通过严格的生物安全措施进行防控。这种防控措施成本高,效果有限,疫 苗是防控传染病最为经济和有效的手段。目前,世界上在研非洲猪瘟疫苗主 要有灭活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、弱毒活疫苗等。
[0003]灭活疫苗:早期疫苗研究主要集中在灭活疫苗。灭活疫苗安全、但细胞免疫应答弱,且很难诱导机体产生有效的中和抗体,对ASFV强毒攻击无有效的保护作用,并可能存在抗体介导的感染增强。
[0004]亚单位疫苗:CD2v、p72、p54和p30蛋白均可诱导中和抗体,可作为亚单位疫苗开发的候选抗原。研究人员利用杆状病毒载体表达相关蛋白来免疫猪群,对保护猪群免受强毒攻击有一定效果。但目前亚单位疫苗中所使用的 ASFV保护性抗原不足以提供完整保护。少数ASFV蛋白作为抗原,即使出现中和抗体,也很难提供有效的免疫保护。
[0005]DNA疫苗:目前报导的DNA疫苗可以在宿主中诱导高水平的特异性T 细胞反应,产生体液免疫和细胞免疫,但仍无法提供有效保护。通 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株,其特征在于:于2021年5月10日保藏于中国典型培养物保藏中心,猪疱疹病毒1型PRV TK
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/gI
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/gE
‑
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p54
+
/p30
+
,保藏编号为:CCTCC NO:V202139;猪疱疹病毒1型PRV TK
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/gI
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/gE
‑
‑
CD2v
+
/p72
+
,保藏编号为:CCTCC NO:V202128。2.一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株,其特征在于:在伪狂犬病毒TK,gI/gE基因处分别定点插入CD2v和p72,且TK,gI/gE基因全部缺失。3.一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株,其特征在于:在伪狂犬病毒TK,gI/gE基因处分别定点插入p54和p30,且TK,gI/gE基因全部缺失。4.一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株的构建方法,其特征在于:采用CRISPR/Cas9编辑PRV病毒株基因组,将PRV的TK、gI/gE基因删除,再利用同源重组修复,在TK和gI/gE基因的位置分别定点插入ASFV的CD2v和p72,或,p54和p30,且TK、gI/gE基因全部缺失。5.根据权利要求4所述的一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株的构建方法,其特征在于:包括以下步骤:S1.获取变异株PRV基因组全长序列;S2.根据变异株PRV的TK、gI/gE基因测序序列设计引导Cas9蛋白特异性切割目的基因的sgRNA,分别为sgRNA
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TK,sgRNA
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gI/gE;在其上设计合成正反向sgRNA单链序列,并将其退火后得到的双链sgRNA连接至PX459质粒上,转化和提取表达sgRNA序列和Cas9蛋白的PX459
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TK、PX459
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gI/gE质粒载体;S3.体外分别扩增TK基因、gI/gE基因左右同源臂TKhmL、TKhmR、gI/gEhmL、gI/gEhmR,通过酶切连接,构建同源臂质粒pUC19
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TKhm、pUC19
‑
gI/gEhm;在各个左右同源臂之间插入CAG
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bGHpA元件,构建出中间质粒pUC19
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TKhm
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CAG
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bGHpA和pUC19
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gI/gEhm
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CAG
‑
bGHpA;S4.化学合成ASFV的CD2v、p30、p54、p72基因序列;S5.利用酶切连接或无缝克隆的方法,进一步构建同源修复供体质粒pUC19
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TKhm
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CAG
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CD2v
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bGHpA、pUC19
‑
TKhm
‑
CAG
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p54
‑...
【专利技术属性】
技术研发人员:唐玉新,叶昱,顾俊,宋德平,黄冬艳,
申请(专利权)人:江西农业大学,
类型:发明
国别省市:
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