一种CD3特异性慢病毒的构建及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种CD3特异性慢病毒的构建及其应用。具体地，本发明专利技术提供了一种融合蛋白、含有所述融合蛋白的病毒载体或重组病毒。本发明专利技术的CD3特异性慢病毒可高效转染哺乳动物细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种CD3特异性慢病毒的构建及其应用
本专利技术属于医学生物
，具体地说，本专利技术涉及一种CD3特异性慢病毒的构建及其应用。
技术介绍
当今癌症发病风险处于高水平，癌症患者不断增加。如果不采取相应的措施，预计到2020年，每年癌症新增患者将达到1500万人。CAR-T细胞(chimericantigenreceptorTcells，CAR-Tcells)疗法作为一种新的肿瘤治疗策略倍受关注。特别是在治疗如难治性前B淋巴细胞白血病(refractorypre-Bcellacutelymphoblasticleukemia)、弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuselargeBcelllymphoma)等血液系统疾病上取得了巨大的突破，各种实体瘤中的治疗和研究也在不断的进展。NOVARTIS公司的KymriahTM和GILEAD公司的YescartaTM先后在2017年的8月和10月被美国食品药品监督管理局(FoodandDrugAdministration，FDA)批准上市，分别批准应用于儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)和成人弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。传统的二代CAR(Chimericantigenreceptors)通常是由单链抗体片段(scFv)、铰链和跨膜区以及衍生自CD3ζ链和CD28或4-1BB的胞内信号区构成。肿瘤的一个主要免疫逃避机制是肿瘤细胞丢失MHC(majorhistocompatibilitycomplex)相关抗原的表达，CAR-T细胞摆脱了MHC的限制，从而增强了其抗肿瘤活性。CAR-T细胞与相应的抗原结合后，活化、增值并杀伤肿瘤细胞，靶细胞耗竭后在胞内信号的调节下，CAR-T细胞水平大幅下降。一些临床试验发现，功能性的anti-CD19的CAR-T细胞可以在患者体内潜伏多年。换而言之，记忆性anti-CD19CAR-T细胞可以为患者提供长久的肿瘤免疫。CAR-T细胞疗法在实体瘤上的治疗效果尚不能让人满意。肿瘤微环境中的不利因素如免疫抑制靶点(PD-L1、LAG3等)、肿瘤代谢环境改变和调解性T细胞浸润都使CAR-T细胞的功能受到抑制。脱靶效应、神经毒性和细胞因子释放综合症(cytokinereleasesyndrome,CRS)等毒副反应也给CAR-T细胞疗法的临床应用带来挑战。但CAR-T细胞疗法总体上来说是行之有效的肿瘤治疗新策略。特别是在具有特定相关抗原的肿瘤，免疫治疗是一种能够很有前景的方案，FDA批准了用于白血病CAR-T细胞治疗，随着技术的进步，实体肿瘤上的应用也只是时间问题。CAR-T细胞疗法是一种高度个体化的精准医疗，整个治疗流程从患者的T细胞开始，在体外经过一系列复杂的基因改造和体外扩增培养，最终回输到患者体内。CAR的稳定表达对于维持CAR-T细胞功能至关重要。虽然治疗原理已得到验证，但整个技术实现的过程和相关技术、人员和设备的配置要求极高。临床环境复杂多变，肿瘤患者数量庞大，在现有的技术条件下，将CAR-T细胞疗法应用于大规模临床实践显得极为困难。有人尝试构建能与患者HLA匹配的同种异体CAR-T细胞，但即使这种尝试获得成功，CAR-T细胞的制备仍是一个复杂的技术过程。慢病毒(lentiviralvector,慢病毒)或γ-逆转录病毒载体是目前临床最常用的基因工程载体。这些基因工程载体能高效、稳定的将目的基因转染到原代细胞(包括一些难以转染的细胞)和细胞系，并稳定表达目的基因。慢病毒与γ-逆转录病毒载体相比的优势在于可以不像γ-逆转录病毒载体需要依赖于细胞分裂的窗口期将目的基因整合到真核细胞基因组。通过使用其他病毒或融合蛋白的包膜对慢病毒进行假型化改造，可以生产出具有细胞类型特异性的病毒颗粒。我们通过改造慢病毒包装体系中的编码包膜蛋白的基因，使慢病毒病毒颗粒具有CD3的特异性。CAR-T细胞治疗的过程复杂繁琐，制备耗时长，使CAR-T细胞疗法难以普及，价格高昂。CAR-T细胞在体外制备的过程中，患者hPBMCs(HumanPeripheralBloodMononuclearCells)中的T细胞活化后，使用慢病毒载体转染CAR基因，包膜蛋白VSV-G非特异性感染，导致非效应性T细胞表达CAR，回输回患者体内时产生竞争性抑制或其他不可预期的免疫反应可能。因此，本领域迫切需要构建一种CD3特异性慢病毒，针对CD3+T细胞群，表达CAR，产生效应性CAR-T细胞，从而提高CAR-T细胞制备效率和精确性，避免非效应性T细胞表达CAR；同时再体内直接生成CAR-T细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种CD3特异性慢病毒，特异性感染CD3+T细胞群，并将CAR基因整合入细胞基因组，使其稳定表达CAR，产生效应性CAR-T细胞，从而提高CAR-T细胞制备效率和精确性，避免非效应性T细胞表达CAR；同时再体内直接生成CAR-T细胞。本专利技术的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述蛋白具有式I所示的结构：L1-Z1-scFv-Z2-TM-Z3(I)式中，各“-”独立地为连接肽或肽键；L1为任选的信号肽序列；Z1为任选的标签多肽元件；scFV为靶向细胞标志物的抗原结合结构域，；Z2为麻风病毒血凝素蛋白(measlesvirushemagglutininprotein)；TM为跨膜结构域；Z3为胞内结构域。在另一优选例中，所述细胞标志物包括正常细胞的特异性标志物。在另一优选例中，所述细胞标志物选自下组：CD3、CD8、CD4、CD79、CD19、CD21、CD81、或其组合。在另一优选例中，所述细胞标志物包括肿瘤细胞标志物。在另一优选例中，所述细胞标志物选自下组：HER2、B7H3、TRKC、EGFR、或其组合。在另一优选例中，所述靶向细胞标志物的抗原结合结构域为抗体或抗原结合片段。在另一优选例中，所述抗原结合片段是Fab或scFv或单结构域抗体sdAb。在另一优选例中，所述式I结构为从N端至C端。在另一优选例中，所述靶向细胞标志物的抗原结合结构域的结构如下式A或式B所示：VH1-VL1(A)；或VL1-VH1(B)；式中，VH1为抗细胞标志物抗体的重链可变区；VL1为抗细胞标志物抗体的轻链可变区；“-”为连接肽(或柔性接头)或肽键。在另一优选例中，所述的式A和B的结构为从N端至C端。在另一优选例中，所述的VL和VH通过一柔性接头相连。在另一优选例中，所述的柔性接头为1-9个(较佳地6或9个，更佳地，3个)连续的(G)4S所示的序列。在另一优选例中，所述的VL和VH各自独立地为鼠源的、人源的、兔源的或人的。在另一优选例中，VL的氨基酸序列包括选自SEQIDNo.:1所示的VL或其衍生VL(或其活性片段)。在另一优选例中，VH的氨基酸序列包括选自SEQIDNo.:2所示的VH或其衍生VH(或其活性片段)。在另一优选例中，所述的VH链本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述蛋白具有式I所示的结构：/nL1-Z1-scFv-Z2-TM-Z3 (I)/n式中，/n各“-”独立地为连接肽或肽键；/nL1为任选的信号肽序列；/nZ1为任选的标签多肽元件；/nscFV为靶向细胞标志物的抗原结合结构域，；/nZ2为麻风病毒血凝素蛋白(measles virus hemagglutinin protein)；/nTM为跨膜结构域；/nZ3为胞内结构域。/n

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述蛋白具有式I所示的结构：
L1-Z1-scFv-Z2-TM-Z3(I)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L1为任选的信号肽序列；
Z1为任选的标签多肽元件；
scFV为靶向细胞标志物的抗原结合结构域，；
Z2为麻风病毒血凝素蛋白(measlesvirushemagglutininprotein)；
TM为跨膜结构域；
Z3为胞内结构域。


2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述细胞标志物包括正常细胞的特异性标志物。


3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述细胞标志物包括肿瘤细胞标志物。


4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。


5....

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：福建;35